Week 2

Question 1

Welke soorten mutaties zijn er?

Answer 1

• Chromosomale afwijking
  
  • Translocatie
  • Amplificatie
  • Deleties
  • Numerieke awijkingen
• puntmutaties
  
  • Transitie: purine(A/G) of pyrimidine(C/T) vervangen elkaar
  • Transversie: purine <-> pyrimidine
  • Kleine inserties/deleties

Question 2

Welke oorzaken van DNA schade zijn er?

Answer 2

• Chemische instabiliteit: gebeurt zonder andere oorzaak
  
  1. Depurinatie: hydrolyse N-glycosyl-verbinding t suiker en base → 1 bp deletie
  2. Deaminatie basen: cytosine → uracil → transitie
• Chemische verbindingen
• Biologische stoffen
  
  1. Oxidatieve DNA schade, zuurstofradicalen → guanine → 8-oxoguanine → transversie(G ipv T)
  2. Benzo(a)pyreen uit sigarettenrook: intracel omgezet in BPDE → bind aan DNA, verstoort dubbelhelix, reageert met G-residue → A ipv C ingebouwd(transversie) ⇒ bulky aduct
• Fysische agentica: UV-straling geeft intrastreng crosslinks(6,4-fotoproducten) en cyclopyrimidine dimeren
• Foutieve replicatie

Question 3

Welke soorten DNA beschadiging zijn er?

Answer 3

• Chemische adducten
• Intrastreng crosslinks
• Interstreng crosslinks= tussen 2 strengen interactie nucleotiden
• DNA strengbreuken: dubbel of enkelstrengs
• Basepaar mismatches

Question 4

Hoe werkt base excisie reparatie?

Answer 4

• kleine adducten(oxidatie schade, deaminatie basen, enkelstrengs DNA breuk)
  1. Herkenning DNA schade: DNA glycocylase herkent en verwijdert nucleotide -> AP-site(niet bij ssDNA breuk)
  2. Excisie: AP-endonuclease herkent AP-site, maakt knip in DNA en verwijdert AP-site
  3. Herstel: DNA polymerase en ligase

Question 5

Wat is nucleotide exicisie reparatie? Welke vormen zijn er?

Answer 5

• voor grote adducten(cyclopirimidine dimeren, 6-4 fotoproducten en bluky adducten), intrastreng crosslinks
• global genome NER: langzaam, voorkomen mutaties
• transcriptie gekoppeld NER: snel, voorkomen apoptose als DNA schade RNA polymerase blokkeert: CSB herkent schade, CSA duwt transcriptiecomplex naar achteren, verder als bij GG NER

Question 6

Waarvoor word een template bij DNA reparatie gebruikt?

Answer 6

• weten welke string gemuteerd is en hoe deze gerepareerd moet worden
• nauwkeurig
• complementaire streng: kleine adducten
• zusterchromatide(DNA replicatie), homologe chromosomen(mitose): intrastreng cross-links, dsDNA breuk

Question 7

Hoe verschillen de recombinatie herstel mechanismen van elkaar?

Answer 7

• interstreng crosslinks en dubbelstreng DNA breuken
• NHEJ: direct aan lekaar ligeren 2 uiteindes, geen templaten -> onnauwkeurig
• HR: uitwisseling DNA strengen tussen DNA moleculen, zusterchromatide -> nauwkeurig

Question 8

Hoe werkt niet-homoloog eindherstel? Wat is het nadeel?

Answer 8

• eiwitten vormen heterodimeer, herkennen dsDNA breuk en binden
• DNA ligase verbind uiteindes
• verlies DNA rond breuk

Question 9

Hoe werkt homologe recombinatie? Wat doet RAD51?

Answer 9

• herkenning breuk
• verwerking tot 2 enkelstrengs staarten
• base pairing gebroken en intacte zusterchromatide
• synthese ontbrekend DNA en ligatie
• resolutie verbonden zusterchromatiden
• RAD51 vormt filament op enkelstrengs staart, bevorder tbaseparing

Question 10

Welke fouten zijn er bij het herstel van dubbelstrengs DNA breuken?

Answer 10

• fout HR: genomische instabilitiet, mogelijk verlies heterozygositeit(mutatie naar gezond chromosoom gekopieerd0
• NHEJ: interne chromosomale deletie(LOH) of translocatie tussen verschillende chromosomen

Question 11

Hoe werken topoisomerase remmers?

Answer 11

Topoisomerase maakt een breuk in 1 streng om de andere te laten passeren, waardoor 2 strengen van elkaar los kunnen komen. Etoposide bevriest het eiwit-DNA complex, waardoor de dsDNA breuk blijft en de cel in apoptose gaat.

Question 12

Wat is synthetische letaliteit?

Answer 12

Bij tumorcellen werkt een reparatiemechanisme, terwijl bij normale cellen meerdere mechanismen zijn, waardoor als je deze uitzet de tumorcellen geen DNA schade repareren en dood gaan terwijl normale cellen wel overleven.

Question 13

Wat zijn eenzijdige dubbelstrengs DNA breuken?

Answer 13

Als een enkelstrengsbreuk replicatie in gaat ontstaat een dubbelstrengsbreuk. NHEJ werkt niet, dus HR.

Question 14

Wat is de BRCA mutatie? Hoe werken PARP1 remmers bij behandeling van geassocieerde tumoren?

Answer 14

• erfelijke deficientie BRCA1/2 waardoor HR niet werkt
• autsomaal dominante overerving, dragers hebben verhoogde kans kanker(borst, ovarium, prostaat)
• endogeen ssDNA breuken agv zuurstofradicalen -> bij replicatie ophoping eenzijdige dubbelstrengs breuken(NHEJ werkt niet)
• PARP1 maakt eiwitstaarten voor reparatie enkelstrengs breuken, BER nu minder efficient
• tumorcellen geen HR -> apoptose

Question 15

Hoe werkt het aantonen van medicatie voor kanker?

Answer 15

• cellijnen
• dierexperimenten: xenograft(menselijk tumor implanteren) -> toxiciteit en effect
• klinische studies
  
  • fase I: toxiciteit
  • fase II: effectiviteit
  • fase III: grotere schaal, effectiviteit

Question 16

Hoe werkt hyperthermie als behandeling van kanker?

Answer 16

• lokaal verhitten tot >40 graden
• vergroot effect radiotherapie
• verhitting geeft afbraak BRCA2, waardoor RAD51 niet ophoopt na schade en HR minder werkt

Question 17

Hoe word de nauwkeurigheid van DNA replicatie bepaald?

Answer 17

• Base selectie: vorm katalytisch centrum DNA polymerase bepaald d base in template
• Proofreading
  
  • Nucleotide in iminotautomeer veranderen(H+ andere plek) → bij C A ingebouwd ipv G
  • Snel terug n aminotautomeer → mismatch, DNA polymerase blokkeert
  • DNA polymerase heeft 3’→5’ exonuclease activiteit, verwijdert verkeerde base en herstelt
• Mismatch reparatie: groep eiwitten herkennen mismatch, rekruteren EXO1 die mismatch weghaalt, DNA polymerase herstelt

Question 18

Wat is het Lynch syndroom?

Answer 18

• defect in mismatch reparatie
• mutatie in MSH6/2, MSL2 en MLH1
• autosomaal dominant
• CRC op jonge leeftijd, andere tumoren(endometrium)

Question 19

Wat is microstallite instability assay?

Answer 19

• microsatellieten= stuk in DNA bestaande uit repeterende sequenties
• Replication slippage: strengen niet goed teruggevouwen
• Meer of minder repeats als fout in mismatch systeem
• PCR: microsatelliet lengte meten
  Replication error fenotype: meer en minder repeats op blot

Question 20

Hoe werkt de diagnostiek en screening bij Lynch syndroom?

Answer 20

• moleculair onderzoek: aangedane persoon, beschikbaar tumorweefsel
• counseling klinische geneticus: wie nog meer onderzoeken? -> psychische belasting
• > 25jr 1x/2jr colonoscopie, bij vrouwen 40-60jr transvaginale echosocpie en endometirum sample, ovaria beoordelen
• geen preventieve systeemtherapie
• leeftijd beinvloed aanpak als geassocieerd CRC(>60jr geen totale colectomie)

Question 21

Wat is familair colorectaal carcinoom?

Answer 21

• geen onderliggende moleculaire afwijking, maar toch in familie veel CRC
• hoger lifetime risico
• screening: >50jr 1x/5jr colonscopie

Question 22

Wat is familaire adenomateuze polyposis? En MUTYH geassocieerd polyposis?

Answer 22

• autosomaal dominant mutaties in APC gen → goedaardige poliepen in dikke darm
  
  • Minder bij Lynch syndroom
    Autosomaal recessief mutatie MYH, geeft APC mutatie in poliep vormende cellen
    Minder poliepen dan bij FAP

Question 23

Wat is een mozaïek mutatie?

Answer 23

mutatie onaantoonbaar, niet in darm/bloed aanwezig, geen ziekte maar wel in andere cellen

Question 24

Wat is een founder/recurrent mutatie?

Answer 24

Alle aangedane personen/dragers hebben dezelfde mutatie bij een erfelijke ziekte

Question 25

Wat is een compund heterozygote?

Answer 25

patient met autosomaal recessieve ziekte heeft twee verschillende mutaties in de allelen

Question 26

Wat is incomplete penetrantie?

Answer 26

Een obligaat drager(moet wel hebben, bv ouder van ziek kind) van een autosomaal dominant defect gen heeft geen klinische kenmerken v/d ziekte

Question 27

Hoe werk global genome NER?

Answer 27

1. Herkenning DNA schade d RAD23 en XPC
2. Ontwinden d helicases
3. Aanbrengen ssDNA breuk
4. Excisie streng fragment d XPG
5. DNA synthese
6. Ligatie

Question 28

Hoe werkt polymerase chain reaction(PCR)?

Answer 28

DNA vermenigvuldigen door herhalen cycli
- verhitting: denaturatie tot 2 enkele strengen
- koeling: primers binden
- Taq polymerase bouwt nieuwe nucleotiden in -> 4 strengen

Question 29

Wat is sequencing? Waarvoor wordt het gebruikt?

Answer 29

• bepalen volgorde nucleotiden in DNA
  Toepassing
• DD
• Therapiekeuze: bepaalde behandelingen voor specifieke mutaties
• Clonaliteitsanalyse: 2e primaire tumor of metastase
• Oncogenetica: erfelijk tumorsyndroom
• Weefselidentificatie: verwisseling pt

Question 30

Wat is target enrichtment?

Answer 30

Vermeerderen van alleen regio van interesse in DNA
- amplicon enrichtment: primer herkent regio en bind, PCR
- hybridzation enrichment: DNA gefragmenteerd en PCR. Selecteren regio met probe(stuk complementair aan gewenst stuk met biotine molecuul), biotine bind aan beads waarmee weer uitgefilterd

Question 31

Hoe werkt sequencing by synthesis?

Answer 31

• adoptoren op DNA fragmenten binden aan flowcel
• clusters gevormd via PCR
• sequencing mbv fluroscentie
• foto gemaakt als nucleotide bind -> volgorde nucleotiden
• meerdere regio’s en patiënten op 1 flowcel -> barcodes(nucleotide sequentie voor en achter regio hangen)

Question 32

Hoe word de data bij NGS verwerkt?

Answer 32

• barcodes en verhouding reads vegelijken met referentie genoom
• uitzetten welke nucleotide op welke plek; als normaal weggelaten

Question 33

Wat is de variant allel frequence en coverage?

Answer 33

Variant allel frequent(VAF)= hoe vaak ander nucleotide op specifieke positie tov referentie → variant coverage : coverage
Coverage= hoe vaak base-positie bepaald, hoe hoger des te dieper
- als 25% tumorcellen -> VAF= 12,5%

Question 34

Wat zijn de verschillen tussen Sanger en Next Generation sequencing?

Answer 34

• mix / single molecule
• 1 fragment/duizenden fragmenten per analyse
• max 1000 basen/20x10^9 basen
• veel/weinig DNA nodig
• lage/hoge gevoeligheid
• poolen wel/niet mogelijk
• eenvoudige analyse/bio-informatica nodig