VL 7 RNA Flashcards
Warum korreliert die Transkriptionsrate nicht unbedingt mit der Transkriptakkumulation?
-es gibt instabile RNAs, die sehr schnell abgebaut werden
Geschwindigkeit Transkription? Rolle C-terminale Domäne?
- starke Geschwindigkeitsunterschiede
- durch DNA-Struktur verlangsamt
- C-terminale Domäne bindet an versch. Faktoren, die bei der Desassemblierung und Reassemblierung eine Rolle spielen
Kurz: Was sind die wesentlichen Unterschiede zwischen Run-On/GroSeq und Net-Seq
- Lösung I: Run-On / Gro-Seq
- zeitliche limitierte Elongation in Gegenwart von markierten Nukleotiden
- Anschließende Anreicherung der markierten RNA
- Detektion der RNA • Einzelgennachweise: qRT-PCR; dot-blot
- NGS
- Lösung II: Net-Seq
- Aufreinigung von an Chromatin gebundenen RNA Polymerasen
- Isolierung der gebundenen RNA
- NGS der RNA
Was ist die run-On-Technik?
- Kern wird isoliert
- >inkubiert mit modifizierten Nukleotiden-> da keine neuen Signale und Energie aus Cytosol kommen werden nur bereits gestartete Transkriptionsvorgänge mit modifizierten Transkripten zuende geführt
- markierte DNA kann dann extrahiert werden
Wie funktioniert Gro-Seq?
- markierte Nukleotide-> Brom-UTP
- Kerne werdenisoliert und Initiation mit Sarkosyl verhindert und Polymerase 10 min laufen gelassen
- RNA isoliert und hydrolysiert
- Beads mit Antikörper gegen Brom-UTP
- >dann library preparation durch Adapterligation
Was wurde mit Gro-Seq über die Richtung der RNA-Pol herausgefunden?
- RNA-Pol läuft in beide Richtungen-> Antisense und Sense vom TSS aus
- auf antisense_strangaber nicht prozessiv
Welche sind die Unterschiedlichen Klassen von Genen, die durch Gro-Seq entdeckt wurden?
- Genklassen basierend auf Aktivität der Transkription
- class 1: not paused, active ->Gro-Seq-Signal entlang des gesamten Gens
- class 2- paused, active: Polymerasen sitzen auf Promotor und können bei Signal angeschaltet werden-> z.B. bei Stress aktiv
- class 3: paused, not active
- class 4: not paused, not active
Was ist Pro-seq?
Kerne isoliert
- nur eine Markierung(Nukleotid mit Biotin markiert->verhindert, dass Pol weitermacht)->genau das Nukleotid bestimmt wo Polymerase gestgoppt hat
- Aufreinigung mit Streptavidin(affin für Streptavidin)
- >Ligationsreaktion-> Adapter an beide Enden
- Stelle kann genau bestimmt werden, wo Adapter angehangen wurde
Vorteil pro-Seq gegenüber Gro-Seq?
-höhere Auflösung->genaue Position, wo die Pol auf der DNA stoppt->Pausierungstypen können bestimmt werden
Was sind die Nachteile von ProSeq?
- Nukleotide schwer in Zellen einzuschleusen
- nur in vitro möglich
- limiterte EInsatzmöglichkeiten
Folie:
The protocol is limited to cell cultures and other artificial systems due to the requirement for incubation in the presence of labeled nucleotides
- Artifacts may be introduced during the preparation of the nuclei
- New initiation events may occur during the run-on step
Was ist/passiert bei Net-Seq?
- native elongating transcript sequencing
- Fokus auf Polymerase
1. Zellen werden eingeforen und danach lysiert
2. Polymerase wird präzipitiert mit RNA-> RNA aufgreinigt-> Linker angehängt und sequenziert
Hat Polymerase bei Netseq in Lysaten noch Aktivität?
-nein-> alpha-Amanitin als Inhibitor der RNA-Polymerase
Was wurde durch Netseq herausgefunden?
- Pausierungsstellen der RNA-Polymerase durch Nukleosomen
- RNA-Polymerasen besitzen einen Rückwärtsgang
Erklären Analyse RNA-Pol 2 Modifikationen über Net-Seq?
- 2 Serine an CTD können modifiziert werden(phosphoryliert)
- sogar während Polymerase durch Gen läuft
- S5P bremst Pol und erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes, während 3´ Exon transkribiert wird
- bei Netseq immer letztes Exon als Ende des reads
