VL 3 Hybridisierung Flashcards
Für welche molekularbiologischen Methoden ist die Hybridisierung entscheidend?
- Blot-Techniken
- • PCR
- RNAi
- CRISPR/Cas
Grob: was ist eine Sonde? Welche Arten von Sonden gibt es?Welche ist die einfachste Methode?
- eine markierte Nukleinsäure die mit einem komplexen Mix aus unmarkiererten Nukleinsäuren(Ziel) hybridisiert
- die einfachste Methode ist ein Oligo-> einfach kaufen
Welche Techniken zur Markierung gibt es? Welche Sondentypen gibt es?
- DNA-Endmarkierung->am 5´ oder 3´-Ende(z.B. über Polynukleotid-Kinase)
- Bodylabeling:
- Nick translation
- random primer
- PCR-basierte markierung
- RNA
in vitro Transkription(durch Einbau markierter nukleotide)
Sondentypen:
radioaktiv und nicht radioaktiv
Wie funktioniert die Endmarkierung mittels Kinase?(nicht häufig)
- Template, dass 5´-Phosphoryliert ist
- dann ATP mit radioaktiv markierten Gamma-Phosphat
- Phosphat wird gegen Phosphat des Oligos getauscht
- nur eine radioaktive Gruppe pro Molekül
Was ist fill-in-Endmarkierung?(nicht häufig)
-DNA wird mit Restriktionsenzymen verdaut, die überstehenden Überhänge werden mit radioaktivem ATp aufgefüllt
-
Wie funktioniert die nick-translation?(nicht häufig)
- DNA wird mit DNAse I(niedrig konzentriert) an einem Einzelstrang geschnitten->nicks entstehen
- nicks sind templates für E-Coli Pol 1(hat exonuklease)
- kann vom 5´ Ende DNA “wegfressen” und den strang am 3´-Ende verlängern und translatiert nick an eine andere Position
- beim Verlängern werden radioaktive Nukleotide(radioaktives alpha-Phosphat) eingebaut
Wie funktioniert random priming?
- Sonde wird denaturiert
- Hexanukleotide mit zufälligen Sequenzen, die hybridisieren
- werden verlängert mit markierten Nukleotiden
Wie werden Ribossonden hergestellt?
- klonierte Sequenz in Vektor-> Vektor wird nach zu transkribierender Sequenz geschnitten, damit nicht Bereich danach transkribiert wird-> Vektor linear
- oder PCR wird gemacht-> Produkt transkribiert
- RNA Pol nutzt markierte UTPs
Was sind die Vorteile der nicht-radioaktiven Markierung?Welche Arten?
- Vorteile:
- Sicherheit
- stabiler
Klassifizierung
- direkt (mit Fluorophor-markiertem Nukleotid)
- Indirekt (Biotin-Streptavidin System)->reaktive Gruppe an Nukleotid, die sekundär mit Fluoreszenzfarbstoff verbunden wird
Was sind die Nachteile von fluorophor-markierten Nukleotiden?Lösung?
- groß und an Base befestigt->von Polymerasen werden diese Nukleotide nicht so gut eingebaut
- je mehr markierte Basen in einer Sonde, desto schlechter die Hybridisierung
- >Lösung: indirekte Markierung mitreaktive Gruppe(z.B. Biotin)
Wie funktioniert Markierung über Click-Chemie?
- in DNA werden Nukleotide mit kleinen superreaktiven Gruppen(Alkin-Gruppen), die mit Azid-Verbindungen sehr effizient reagieren, eingebaut
- Fluorophor an Azid gekoppelt
Was ist Stringenz?
-charakterisiert wie gut mit Sonde das Ziel identifiziert wird, gegenüber Hybridisierung mit Nicht-Zielen
UV-Absorptionseigenschaften DNA?Reinheitsmessung? Wie kann über UV das verhältnis von oppelsträngiger zu Einzelsträngiger DNA bestimmt werden?
- peak bei 260 durch Basen
- Verhältnis 260/280
- Einzelstrang hat höhere Absorption bei 260 nm als Doppelstrang
- bei Temperaturerhöhung-> sigmoider Graph = Kooperativität
- > wenn ein Bereich denaturiert hilft das auch anderen bereichen zu denaturieren
Wie kann die Stringenz beeinflusst werden?
-Agenzien dazu gegeben, die Doppelstränge destabilisieren(Formaldehyd, Harnstoff)-> Hybridbildung wird erschwert
- Ionenstärke
- Basenzusammensetzung (G/C%, repetitive DNA)
->stärkere Hybride
- Mismatches
- Duplexlänge->je länger die Sequenz, desto höher die Stringenz
- Viskosität->je höher viskos das Medium, deto besser finden sich die Aminosäuren
- Probenkomplexität->je mehr Alternativen zu Zielsequenz, desto mehr mismatches
- pH->weil bei hohem pH Basen deprotonieren und so keine Watson-crick-Basenpaarungen mehr eingehen können
