VL 1 Klonierung

Question 1

Welche Arten natürlicher und artifizieller Klonierung gibt es?

Answer 1

Artifizielle Klonierung:

– Reproduktives Klonieren –> Das gesamte Tier wird ausgehend von einer Zelle durch asexuelle Reproduktion erstellt

– Therapeutisches Klonieren –>Kein identisches Individuum, sondern Erstellung von Gewebe. – Genklonierung -> Gene oder Genfragmente werden kloniert

• Natürliche Klonierung: - Klonieren von einzelligen Organismen durch Isolierung – Pflanzliche asexuelle Replikation (Apomixis) – Zwillinge

Question 3

Wie wird beim therapeutischen Klnoieren aus einer somatischen Zelle eine pluripotente Zelle gemacht?

Answer 3

IPSC- induzierte pluripotente Stammzellen

• plurpotente Stammzellen, die durch künstliche Reprogrammierung aus nicht-pluripotenenten Somatischen Zellen entstanden sind
• durch von außen angeregter Expression von TFs

Question 4

Wie funktioniert die Klonierung aus Einzelzellen in Pflanzen

Answer 4

-Zellen vereinzelt und dann mit Hormonen behandelt

Question 5

Welche zwei Arten von Klonierung bei Tieren?

Answer 5

1. Kerntransfer: Kern aus somatischer Zelle in Eizelle: (z.B. Dolly das Schaf) Zelle aus Euter entnommen-> Hungern lassen(damit Zellen den Zellzyklus verlassen, sichnicht mehr teilen und die G0-Phase betreten)->in Eizelle und dann mit elektrischem Reiz behandelt
2. Embryosplitting-> Embryo durchtrennt

Question 6

Was sind Probleme beim Klonieren?

Answer 6

-erstmal eine extrem niedrige Effizienz

Probleme:

• Geringe Lebenserwartung / Krankheiten
• Unterschiede wegen somatischer Mutationen
• Niedrige Erfolgsrate: 0.1 - 3%
• Dedifferenzierung nicht komplett
• Telomere können verkürzt sein
• Mitochondrien können defekt sein

Question 7

Was passiert bei der Shotgun-Klonierung?

Answer 7

-Klonierungsverfahren bei dem gesamtes Genom in ähnlich große Fragmente gespalten werden und in Klonierungsvektoren einkloniert wird

Question 8

Was sind stringente und was sind relaxierte Plasmide?

Answer 8

Stringente Replikationskontrolle: Plasmid-Replikation und Replikation der Wirts-DNA sind eng miteinander gekoppelt. Diese Plasmide kommen in der Zelle in geringer Zahl (1-2 Kopien) vor und werden als low copy number-Plasmide bezeichnet.

Relaxierte Replikationskontrolle: Die Plasmide replizieren vollständig unabhängig von der Wirts-DNA. Sie liegen in hohen Kopienzahlen von 10-200 in der Zelle vor und werden als high copy number- oder multicopy-Plasmide bezeichnet. Bei high copy number-Plasmiden liegt die Kopienzahl per Definition über 20.

Question 9

Was ist ein Polylinker?

Answer 9

• auch multiple cloning site genannt
• künstlich geschaffenes DNA-Oligonukleotid aus rund 50bp, welches in ein Plasmid eingesetzt wurde und dessen Sequenz direkt hintereinander verschiedene Restriktionsschnittstellen für Restriktionsendonukleasen enthält.
• innerhalb von lacZ als Reportergen und Antibiotikaresitenz

Question 10

Was sind Nachteile des traitionellen Klonierens?

Answer 10

1: verfügbare Restriktionsschnittstellen sind limitierend
2: Multiple Arbeitschritte (e.g. Gelaufreinigungen von DNA-Fragmenten)
3: Transfer von Inserts von einem Vektor zum nächsten meist nicht trivial (e.g. auch um den Leserahmen zu erhalten) ->d.h. um ein Gen auf verschiedenen Arten zu untersuchen muss es immer wieder neu kloniert werden

Question 11

Wie funktioniert die Gatewayklonierung?

Answer 11

• basiert auf sequenzspezifischen Rekombinationssytem des Phagen Lambda
• Phage Lambda kann mit bestimmten Enzymen seine DNA in E.Coli integroieren

die Insertion und Exzision benutzt dieselben Sequenzen, aber unterschiedliche Enzyme:

• Integration (attB x attP): Integrase (Int) und host integration factor (IHF). Es entstehen die Stellen attL and attR, die den integrierten Prophagen flankieren
• Keine DNA Sequenzen gehen verloren
• Exzision (attL x attR): Integrase (Int); host integration factor (IHF); Excisionase [Xis]: es entstehen attB in E. coli und attP in lambda

Question 12

Was geschieht beim Golden-Gate-cloning?

Answer 12

-auf Restriktionsenzymen basierend(TypIIs), die neben der Sequenz schneiden(auch bei nicht palindromischen Erkennungssequenzen)-> Produkt nicht mehr verdaubar-> Reaktion irrversibel

Question 13

Wie funktioniert Gibson Cloning?

Answer 13

• PCR Produkte
• komplementäre Enden zueinander, die über Proimer angehangen wurden
• Exonuklease frisst einen Strang der doppelsträngigen DNA an
• komplementäre Einzelstränge können hybridisieren und Polymerase füllt Lücke und Ligase ligiert