VL 6 Chip Seq

Question 1

Was wird bei ChiP-Seq untersucht?

Answer 1

• Zielproteine • Transkriptionsfaktoren • Histone (verschiedene Typen und Modifikationen) • RNA Polymerase (indirekte Transkriptionsaktivitätsmesseung) • DNA Polymerase (Analyse der DNA Replikation) • DNA Reparaturenzyme
• … oder modifizierte (z.B. methylierte) DNA-Fragmente

Question 2

Wofür steht ChIP?

Answer 2

Chromatin Immuno Präzipitation

Question 3

Wie läuft eine ChIP ab?

Answer 3

1. DNA und Proteine werden miteinander vernetzt -> Crosslinking
2. Zelle wird lysiert
3. Unltraschallbehandlung der DNA-> Fragmentierung
4. Antikörper gegen Histonmodifikatioon oder bestimmtes Protein

Question 4

Wie funktioniert das Crosslinking?

Answer 4

• mit Formaldehyd
• vernetzt Proteine mit DNA, indem es Aminogrippe von Aminosäuren und Aminosäuren von DNA-Basen vernetzt

Question 5

Wie funktioniert die Immunopräzipitation?

Answer 5

Protein wird mit bestimmten Epitope-Tag markiert

• für den Epitopen gibt es spezifischen Antikörper-> z.B. gegen Histonmodifikation
• Antikörperchen auf bea geladen-> diese binden an Proteine
• Aufreinigung und dann eluieren der DNA
• >Crosslink mit hoher Temperatur rückgängig gemacht

Question 6

Warum sind kurze reads bei der ChIP-Seq von Vorteil?

Answer 6

-erlaubt eine hohe Auflösung und so eine genaue Bestimmung der Position der Proteine oder Histonmodifikationen

Question 7

Wie wird die DNA-Library angefertigt nach der ChIP?

Answer 7

1. Vorbereiten der DNA.Fragmente:Polymerase fühlt ungenau überhängende Enden auf
2. Adapterligation-> Linker mit Barcode, PCR Amplifikation
3. Library Sequenzierung

Question 8

Welche Kontrollen werden für ChIP gemacht und warum?

Answer 8

1. Input DNA Chromatin ohne IP-> Fragmente werden unterschiedlich gut mit Adaptoren ligiert und amplifiziert, um potentiellen bias der Sequenzierfähigkeit der DNA aufzudecken
2. kein Antikörper oder unspezifischer Antikörper(IpG): DNA und Proteine interagieren unspezifisch miteinander und bead interagiert mit DNA-> Hintergrund von DNA, die präzpitiert wird

es wird gemessen was unspezifisch präzipitiert wird

3. kein Tag: IP von Probe ohne getagtes Protein->auch für Sichtbarmachen des Hintergrunds

Question 9

Workflow ChIP-Seq Data?

Answer 9

-FAstQ->Quality Check->Mapping auf Referenzgenom ->Coverage-Plot: wo sind Anreicherungen

Question 10

Wie bekommt von Peaks zur Postition des TFs? Warum klappt das nicht immer?

Answer 10

• reads von beiden Strängen zu coverage Graphen
• eigentlich zwei peaks-> einer auf dem - Strang und einer auf dem + Strang
• an unterschiedlicher Position +Strang oder -Strang reads upstream oder downstream vom TF
• bei mehreren Bidestellen mehrere überlappende Maxima

Question 12

Was ist die Kartierung von Bindestellen mittels Tag-Verschiebung?

Answer 12

reads werden Verschoben um d/2(Hälfte der durchschnittlichen Fragmentlänge)

Question 13

Was ist eine Normalisierung bei ChIP und warum nicht über FPKM bzw. RPKM? Lösung?

Answer 13

• bei ChIP Experiment sehr starke Signale und bei Input und negativ-kontrolle sehr geringe Signale dazwischen
• so wird noise überschätzt und peaks stechen aus Hintergrund nicht mehr raus
• ausßerdem können kleinere peaks als nicht signifikant gewertetwerden
• Lösung: peak-calling-> peaks aus Normalisierungsanalyse herausgeschnitten
• >

Question 14

Welche Informationen können genutzt werden, um von einem ChIP-peak zur Funktion zu kommen?

Answer 14

• Position des peaks im Genom(in der Nähe zu TSS oder distale (= enhancer) Region)
• nächste Gene zum peak?
• gibt es genomweit eine Anreicherung von bestimmten Genfunktionen (e.g. GO Kategorien) um die peaks?
• oder bestimmte Sequenzen(k-Mere)

Question 15

Nachteil beim Fokus auf Gene neben den peaks?

Answer 15

Fokus auf proximale Regionen führt zum Verlust von einer großen Zahl von Bindestellen-> Enhancer können auch auf distale Gene Einfluss haben

• “Nächstes-Gen” Ansatz induziert Bias hin zu Genen mit großen intergenischen Bereichen
• e.g. : “multicellular organism development” : 14% aller Gene, but 33% des Genoms

Question 16

Was ist DNAseI Hypersensitive mapping?

Answer 16

• Regionen die nicht stark verpackt sind, können von DNAse I(Exonuklease) geschnitten werden
• diese Regionen sind transkriptionsaktiv, da es zur Bindung von funktionellen Proteinen wieTFs eine geringe Verpackung benötigt
• mit DNAse Seq können dann die übrigen Sequenzen sequenziert werden und so bestimmt werden welche Sequenzen aktiv sind

Question 17

Was ist FAIREseq?

Answer 17

• Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements
• es wird Formaldehyd genutzt um Proteine und DNA zu vernetzen->stark verpackte DNA bildet DNA-Histon-Verbidnungen
• dann wird ausgenutzt, dass Proteine in Phenol-chlorophorm löslich und DNA nicht-> nur an Protein-gebundene DNA löstsich
• ungebundene DNA kann sequenziert werden

Question 18

Wie funktioniert ATAC?

Answer 18

• Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing
• Transposase(TN5-Transposon) genetisch verändert, dass es viel aggressiver wird
• schneidet an beleiebigen Stellen der DNA und hängt DNA-Fragmente an Schnittstellen 2 Linker an, die fürs Sequenzieren benutztwerden können

Question 19

Was ist und wie funktioniert 3C?

Answer 19

• chromatin conformation capture
• zur Bestimmungder 3D-Struktur des Chromatins im Zellkern
  1. über Crosslink mit Ziel versch. DNA-Bereiche die in der Zelle benachbart sind zu verknüpfen-> zeigt wo versch. chromosomale Berecihe relativ zueinander liegen
  2. dann wird geschnitten und ligiert
  3. Crosslink aufgelöst
  4. Primer für Bereich von Interesse-> unbekannter Bereich amplifiziert