Vl 2 Crispr Flashcards
Was sind Zinkfingernukleasen?Was sind TALEN-Effektornukleasen
Zinkfingernukleasen:
- Fusionsproteine aus jeweils einer Fok-Nuklease und 5 Zinkfigerdomänen, die 10 Basenpaare erkennen
- auf beiden Seiten eines Doppelstrangs
TALEN:Transcription Activator-like Effector Nuclease
-Fok-Nukleasen, mit TAL-Effektordomänen->viele TAL-Effektordomänen hintereinander fusioniert-> jede Domäne spezifisch für eine Base
Was bedeutet CRISPR?
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
Wie sieht der Crispr-Locus aus
CRISPR-Locus
short palindromic repeats und dazwischen Spacer->identisch zu Bakteriohagen DNA
-Cas-Operon: Cas-Gene und andere Gene, die für adaptive Immunantwort nötig sind(Helikasen, Nukleasen etc.)
Wie funktioniert die Immunreaktion durch Crispr?
- wenn Bakterien mit Phagen infiziert wurden, integrieren Bakterien Teile der Fremd-DNA in ihr Genom
- crRNA-Transkription und -Prozessierung: Der CRISPR-Genlocus wird zur prä-crRNA transkribiert und anschließend zur reifen crRNA prozessiert.
- reife crRNA assoziiert mit Hilfe der tracr-RNA mit Cas-Protein oder Cas-Proteinkomlpex. Bei Crispr-Cas System von Typ 1 und 2 kommt es bei der Interaktion des Komlexes mit PAM zur Degradierung der DNA. Typ III benötigt keine PAM-Sequenz
Warum wird an PAM-Sequenz geschnitten
-verhindert Autoimmunkrankheit
Was passiert wenn Pam erkannt wurde?
- Stranginvasion
- RuvC und andere nuklease schneiden jeweils einen Einzelstrang
Was ist die sgRNA?
-single-guide RNA -> Fusion aus crRNA und tracrRNA
Welche Arten der Zelle gibt es die Läsionen durch Crispr zu reparieren?
- non homologous end-joining->es kommt zur Insertion oder deletion
- homology directed repair: es wird eine Donor DNA zum Einbau benutzt
Warum ist CRISPR/Cas9 so viel besser als TALENs / ZFNs?Nachteile?
-Ändern der Spezifität benötigt nur ein neues Oligo, kein Proteindesign! Design grundsätzlich wesentliche einfacher und mit viel höherer Erfolgsquote.
Nachteil:
• Spezifität limitiert durch Länge der crRNA-Ziel Homologie
Welche unterschiedliche Methoden gibt es Crispr Cas zu benutzen?
- Indel->Einfügen von Insertionen oder Deletionen durch nHEJ
- Insertion von DNA Fragmenten über homologous end joining
- mehrere Cas-Komplexe -> 2 Doppelstrangbrüchen->große Deletionen oder Rearrangements
- mutiertes Cas9, das keine Endonuklease hat mit Aktivator Domäne -> für Gen-Aktivierung
- mutiertes Cas9 mit Effektor-Domäne, die DNA modifiziert
- ” “ “ mit Reporterdomänen-> Sichtbarmachung bestimmter Bereiche auf der DNA
Was lässt sich zu off-targets sagen?
Verschiedenste Detektionsmethoden: immer werden einige wenige off-targets mit gleichen oder höheren Schnittraten gefunden
- GUIDE-seq, HTGTS, IDLV capture und Digenome-seq haben alle zur Identifikation von Zielen mit bis zu 6 Fehlpaarungen im Protospacer und / oder im PAM geführt
- Mutationen enstehen an Stellen mit Ähnlichkeit zur on-target Stelle und sind nicht zufällig
- Jede Cas9 target site hat etwa 10,000 Stellen im Humangenom, die sich in 6 oder weniger Stellen unterscheidet
- In silico Vorhersagen momentan unmöglich
- Bulges in der target site sind beobachtet worden
- Translokationen zwischen on und off-targets sind beobachtet worden
Was ist eine Methode, um off targets bei Crispr Cas zu detektieren?
1.
- dCas9-> Epitope Tag mit Antikörper
- Chip-Seq
- Fragmente ohne Casß abgetrennt
4. NGS mit dCas9 Fragmenten
2. Guide-Seq
Oligos durch Cas eingebracht und dann NGS und nach oligos gesucht
Wie können off - target Effekte minimiert werden?
I. Kurze Expressionszeit der sgRNA
II. Veränderte sgRNA -> katalytische Aktivität sinkt bei weiteren Fehlpaarungen->erhöhte Stringenz
III. Zwei Nukleasen->eine Nuklease mutiert, sodass 2 Cas9 genutzt werden, um Doppelstrangbruch dzu machen-> erfordert mehr Basenpaarung / veränderte Nukleasen-> 2 dCas9 mit Fok
