VL 4: PCR

Question 1

Was ist Real-Time-PCR?

Answer 1

• Real-Time PCR ist eine spezialisiertTechnik, die es erlaubt, eine PCR Reaktion “in Echtzeit” zu visualisieren
• gibt an wie viel von amplifizierter DNA vorhanden war

Question 2

Ergebnis qPCR? Was istder cq?

Answer 2

• DNA-Menge aus PCR ist proportional zu durchlaufenen Zyklen
• >Graph DNA-Menge auf Y-Achse und Anzahl der Zyklen auf der x-Achse
• >X-AchsenVerschiebung der Kurven korreliert mit DNA Menge zu Beginn der Reaktion
• Cycle-quantity-Werte sind willkürliche Werte-> Zyklenanzahl bei der ein bestimmter Fluoreszenzwert erreicht ist(muss sich in exponentieller Phase befinden -> Cq-Wert
• > DNA(Menge) ~ 2 Cq

Question 3

Was ist der Ct-Wert?Exponentielle Phase?

Answer 3

Grenzwert / Threshold: künstlich ausgewählter Fluoreszenzwert über dem Hintergrund

• Ct: “Cycle threshold” • Die PCR Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz höher als der Grenzwert / threshold ist

• Der Ct-Wert wird nahe an den Beginn der exponentiellen Phase gesetzt
• Exponentielle Phase: Reagentien nicht limitierend • Produkt hat noch keinen Einfluss auf Reaktion

Question 4

Wie funktioniert die relative Quantifizierung über qPCR?

Answer 4

1. ΔΔCt Methode

• Annahme: Amplifikationseffizienz ist gleich für Ziel und Referenz

▫ Verdopplung der Produkte mit jedem Zyklus (exponentielles Wachstum)

• Ratio = 2^-ΔΔCt

Question 5

Was bedeutet: Ratio = 2^-ΔΔCt ?

Answer 5

Question 6

Wie messen wir DNA während der PCRReaktion?

Answer 6

-Reagentien, die fluoreszieren, wenn sie mit DNA interagieren

Question 7

Welche Fluoreszenzfarbstoffe werden für qPCR genutzt?

Answer 7

• anfangs Ethidiumbromid, dass wenn es mit DNA interkaliert fluoresziert
• SYBR-Green-> stärkere Fluoreszenz->heute mehr benutzt:

lagert sich in Doppelstrang ein: umso mehr Doppelstrang, desto mehr Fluoreszenz

Question 8

Was sind TAQ-Man-Sonden? Vorteil gegenüber Fluorszenzfarbstoffen?

Answer 8

• mit Fluoreszenzfarbstoffen wird jede Menge an Amplfifkat gemessen(auch falsch amplifiziertes)
• TAQ-MAN-Sonde ist ein Nukleotid mit Fluorophor an einem Ende und Quencher am anderen
• solange Fluorophor und Quncher zusammen sind-> keine Fluoreszenz und Energie wird in Form von Wärme abgegeben
• wenn TAQ-Pol die SOnde mit Exonuklease frisst wird Fluorophor und Quencher frei-> Fluoreszenzsignal entsteht

-

Question 9

Wofür Schmelzkuren? Wie betrachtet?

Answer 9

• sagt aus, ob Amplifikation gut war-> bei SYBR-Green
• geschmolzene DNA bindet keinen Farbstoff mehr
• es wird die erste Ableitung der Schmelzkurve betrachtet: versch. Maxima repräsentieren untersch. PCR-Produkte

Question 10

Precision Melt Analysis?

Answer 10

erlauben eine Differenzierung zwischen PCR-Produkten, die sich nur in einer Base unterscheiden

• Für Screens nach Mutanten, Analysen von biologischer Diversität, genetischerTests

Question 11

Was kann bei der PCR schiefgehen(trouble shooting)?(Folien angucken)

Answer 11

Replikate:

Pipettierfehler

– PCR nicht optimiert

– Verdunstung in der Probe

– Kalibrierung des Experiments

Baselines:

– Verdunstung

– Luftblasen

– Reaktionsansatz nicht gemischt

Kurvenform

– Kurven repräsentieren keine PCR-Produkte!

– Probenverdunstung

– Fluoreszenz Drift; Fluorophore kaputt

Schmelzkurven

– Mehr als ein Produkt

– Primer-Dimere

– Zu niedrige annealing Temp.

– Neue Primer machen