virusni i virusno-plazmidni vektori

Question 1

podjela vektora na temelju otkud dolaze

Answer 1

plazmidni vektori
virusni vektori
virusno-plazmidni vektori
umjetni kromosomi

Question 2

objasni virusni vektor fag lambda

Answer 2

• umjereni virus (temperirani tj. lizogeni bakteriofag) – lizogeni ciklus
• dobro karakteriziran (dostupno puno mutanata)
• genom - dvolančana linearna DNA, duljine 48.514 bp, ima oko 60 gena, na krajevima je sekvencija cos (kohezivni, ljepljivi krajevi) dugi 12 pb

Question 3

kako nastaje infektivna čestica kod faga lambda

Answer 3

infektivna čestica nastaje kada se u kapsidu upakira 39 do 51 kb DNA (između dviju cos sekvencija)
ostaje infektivan i nakon uklanjanja pojedinih velikih dijelova genoma i još uvijek može lizirati bakteriju

Question 4

kada virusna čestica postaje infektivna

Answer 4

kad se u njoj nalazi 39 do 51kb

Question 5

kakvi mogu biti vektori faga lambda

Answer 5

insercijski i supstitucijski

Question 6

objasni insercijski vektor

Answer 6

to je DNA faga lambda kojem je izbačena sredina genoma faga i imamo lijevu (16kb) i desnu ruku (24kb), na oba kraja se nalaze cos sekvence, lijeva i desna ruka zajedno čine genom velik 44kb zbog čega je najveći insert koji se može ubaciti u genom veličine do 11kb (on se ubacuje u restrikcijsko mjesto između lijeve i desne ruke)

Question 7

objasni supstitucijski (zamjenski) vektor

Answer 7

DNA faga ima lijevu (22kb) i desnu ruku (6kb) i sredinu (11kb)
insert se ubacuje u genom faga tako da se pocijepa na dva mjesta restrikcijskim enzimom, ukloni se sredina i ubaci insert, veličina inserta je od 9 do 21kb

Question 8

objasni kloniranje u fagu lambda

Answer 8

1. cijepanje vektora restrikcijskim enzimom
2. eliminacija sredine (kod supstitucijskog vektora) - radi se preparativna gel-elektroforeza i iz gela se izoliraju lijeva i desna ruka
3. ligacija lijeve i desne ruke vektora i fragmenata DNA, ligiraju se i cos sekvence (kompatibilni krajevi) - može doći i do ligacije lijeve i desne ruke, bez da se insert umetne između njih
4. pakiranje DNA u virusnu česticu in vitro - sklapanje virusnih čestica in vitro (glave + repovi + DNA = infektivna čestica s insertom)
5. infekcija bakterije E. coli s in vitro pakiranim fagima - nastaju plakovi (bistre zone na agarnoj podlozi) - samo oni koji su infektivni
6. izolacija faga iz plakova - plak se izreže i stavi u pufer (fagi difundiraju u pufer)
7. suspenzija faga se sprema u banku gena

Question 9

objasni pakiranje in vitro

Answer 9

sklapanje infektivnih virusnih čestica komplementacijom in vitro
- potrebna su dva lizogena soja bakterije E. coli
(1) mutacija u genu koji kodira za protein repa i pakiranje - nakon indukcije litičkog ciklusa nastaju glave faga
(2) mutacija u genu koji kodira za glavni protein kapside - nakon indukcije litičkog ciklusa nastaju repovi faga
- lizati se pomiješaju i doda im se DNA (glave + repovi + DNA): protein A (terminaza) prepoznaje i cijepa cos sekvencije; pakiranje DNA uz utrošak ATP-a (od cos do cos)
- fagi su infektivni samo ako sadrže 39 do 51 kb DNA
- infekcija E. coli – nastaju plakovi

Question 10

koje su prednosti i mane faga lambda kao vektora za izradu banke gena

Answer 10

uspješnost izrade banke gena – visoka
veličina fragmenata u banci gena – ujednačena
jednostavnost/kompliciranost izrade banke gena – komplicirana
čuvanje (održavanje i obnavljanje) banke gena – komplicirano
pretraživanje banke gena – najviše ovisi o metodi pretraživanja

Question 11

što su kosmid/kozmidi

Answer 11

virusno-plazmidni vektori
plazmidi koji sadrže sekvenciju cos (14 pb)
veličina: ~5-6 kb

Question 12

koje su osnovne sekvencije u kozmidima

Answer 12

ishodište replikacije u E. coli (ori)
rezistencija na antibiotik
sekvencija cos
polilinker (MCS)

Question 13

koje su prednosti kozmida

Answer 13

veličina kloniranih fragmenata: 34-46 kb (jako ujednačena)
velika uspješnost kloniranja
ne nastaju plakovi nego kolonije E.coli
(u banku gena se sprema suspenzija E.coli)

Question 14

objasni kloniranje kozmida

Answer 14

imamo kozmid kojeg treba linearizirati, ali naravno ne u sekvencu cos jer ako ga lineariziramo u sekvenci cos ne možemo onda ništa radit. Dodamo naše fragmente, inserte i napravimo ligaciju. S ligacijskom smjesom se radi in vitro pakiranje i s tim fagima inficiramo E.coli te kao rezultat dobivamo kružni kozmid i onda takvu bakteriju spremamo u banku gena

Question 15

kakvo može biti cijepanje kozmida/genomske DNA koju želimo ubacit u plazmid

Answer 15

može biti potpuno cijepanje ili parcijalno cijepanje (enzim ne reže 100%, nasumićno će pocijepati neka mjesta, a neka neće, neke molekule DNA će biti pocijepane na svim mjestima, neke samo na nekim, a neke uopće neće biti pocijepane)

Question 16

kakvi su to vektori na osnovi faga P1

Answer 16

vektor se sastoji od dva dijela
- jedan dio: sekvencije pac i loxP
- drugi dio: loxP, plazmidna DNA (ori, KanR)

Question 17

objasni kloniranje vektora na osnovi faga P1

Answer 17

1. ligacija inserata i dva dijela vektora
2. pakiranje in vitro
   - cijepanje DNA pomoću pakaze u regiji pac
   - u kapsidu ulazi do 115 kb DNA
   - pakiranje ide od pac do pac regije
3. infekcija bakterije E. coli (cre+)
4. mjesno-specifična rekombinacija između dviju sekvencija loxP
   - nastaje kružna molekula DNA (gubi se plazmidna DNA?)
   - kolonije rezistentne na kanamicin

Question 18

što je loxP

Answer 18

sekvencija duga 34 bp; dva obrnuta ponavljanja duljine 13 pb odijeljena sekvencijom duljine 8 pb

Question 19

što je rekombinaza Cre

Answer 19

katalizira recipročnu rekombinaciju između dviju sekvencija loxP