elektroforeza Flashcards
što je elektroforeza
dijagnostička metoda koja omogućava razdvajanje i vizualizaciju fragmenata DNA, njome provjeravamo što smo sve napravili s našom DNA
nabroji neke karakteristike elektroforeze
migriranje nabijenih čestica u električnom polju kroz neki nosač
provodi se u odgovarajućem puferu koji služi kao elektrolit
razdvajanje molekula u električnom polju na temelju fizikalno kemijskih svojstava (naboj, veličina, struktura . . .)
koje sve nukleinske kiseline se mogu pratiti elektroforezom
DNA (ds i ss), RNA, DNA/RNA-hibrid, oligonukleotidi
prema kojem polu migriraju NK
prema pozitivnom polu, zbog fosfatnih skupina
kakvi sve mogu biti nosači
agarozni i poliakrilamidni gel
o čemu ovisi brzina migracije
- veličini molekule (fragmenta)
* manje molekule migriraju brže - konformaciji molekule (!!!)
* jednolančane i dvolančana molekule; specifične strukture
* dvolančana DNA - linearna, kružna, superzavijena - koncentraciji nosača
* veća koncentracija – manji promjer pora – sporija migracija
* migriracija je sporija što je koncentaracija nosača veća - naponu
* migracija je brža pri većem naponu
* previsoki napon – zagrijavanje i lošije razdvajanje
* uobičajeno 2 do 10 V/cm
* sekvencioniranje (denaturirajuća poliakrilamidna elektroforeza)
1700 V (400 V/cm) - puferu (elektrolit) – pH=8
* fosfatni, boratni, acetatn
kakav je agarozni gel
stvara ga agaroza, ona se izolira iz morskih algi (rodovi Gelidium i Gracilaria)
pročišćavanjem se uklanjaju drugi šećeri, proteini, soli . . .
prosječna duljina lanaca – oko 800 monomera galaktoze
kakva se agaroza koristi za elektroforezu i kakvih još vrsta ima
za elektroforezu se koristi jako pročišćena agaroza
agaroza niskog tališta (“low melting point”) – talište sniženo na oko 65°C
koja je konc. agaroze u gelu
0,5 do 2% (do 5%)
koji opseg razdavajanja ima agarozni gel
od 100 pb do 25 kb
kakav je poliakrilamidni gel
to je polimer akrilamida, akrilamid je toksičan, ima moć razdvajanja molekula kraćih od 2000 nukleotida
kakva se elektroforeza provodi kad se koristi poliakrilamidni gel
elektroforeza DNA se često provodi u denaturirajućim uvjetima (elektroforeza jednolančanih molekula)
koristi se i za razdvajanje molekula čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid
to sve omogućava sekvencioniranje DNA
Agarozna vs poliakrilamidna elektroforeza
priprema nosača - kod agarozne e. je jednostavnija, a kod akrilamidne je kompliciranija između dva stakla
uređaji - kao agarozne e. su jednostavniji (horizontalni), a kod akrilamidne su kompliciraniji
koncentracija nosača (%) - agarozna 0,5-2 (5), a akrilamidna 3,5-20
veličina molekula koje se razdvajaju elektroforezom - agarozna 100-25000 pb, akrilamidna kraće od 2000 n
nabroji neke uređaje za elektroforezu
Horizontalna agarozna elektroforeza, gel leži u puferu
Vertikalna poliakrilamidna elektroforeza, gel je između dva stakla, najčešće se koristi za elektroforezu proteina
Vertikalna poliakrilamidna elektroforeza, gel je između dva stakla, gel je dugačak jer se koristi za sekvencioniranje DNA
Uređaj za automatizirano sekvencioniranje DNA, poliakril amidni gel u kapilari
kako se odabire konc. nosača
odabire se prema očekivanoj veličini fragmenata - manji fragment – veća koncentracija nosača
Za razdvajanje jako velikih fragmenata koristi se elektroforeza u promjenjivom električnom polju (pulsirajuća elektroforeza)
koje su komponente boja za nanošenje uzorka
saharoza, glicerol ili fikol (specifična težina veća od vode - omogućuje da uzorak upadne u jažicu)
obojene komponente - xylene cyanol i bromfenol plavo - omogućuju detekciju uzorka, da znamo gdje se nalaze fragmenti DNA i da ne bi izašli iz gela u pufer
Tris-HCl i EDTA (stabilnost)
kako se vizualizira DNA
gel, nakon elektroforeze, inkubirati u otopini etidij-bromida (1 μg/ml) 15-20 minuta
interkalira u DNA, apsorbira UV svjetlo i emitira svjetlo valne duljine 590 nm (narančasto-crveno)
etidij-bromd je mutagen
elektroforeza dvolančane DNA u agaroznom gelu
elektroforeza se može koristiti za određivanje (procjenu) duljine fragmenata DNA ali samo ako je DNA linearizirana
ne može se koristiti za određivanje duljine cirkularnih (kružnih) molekula DNA (PLAZMIDI) jer te mol. mogu biti super-zavijene te to utječe na brzinu kretanja DNA kroz gel (kreću se brže)
kako migrira super-zavijena DNA kroz gel
Više super-zavijena DNA brže migrira
tijekom elektroforeze
zašto su kod nekih rezultata elektroforeze donje vrpce slabijeg intenziteta
jer se u njima ukupno nalazi manja količina fragmenata, manja masa DNA, nego u gornjoj vrpci,
što je OC
open circle, otvoreni krug
što je SC
supercoil, super-zavijeni krug, isto što i CCC- covalently closed circle
kakva sve može biti konformacija plazmida
superzavojnica, SC - ne sadrži ni jednolančani ni dvolančani lom
otvoreni, relaksirani, nikirani plazmid (OC) - sadrži jednolančani lom (“nick”)
linearna DNA - sadrži dvolančani lom (DSB) – dva bliska jednolančana loma u komplementarnim lancima
o čemu ovisi brzina migracije pojedinih struktura plazmida
ovisi o uvjetima elektroforeze, ali obično najbrže migrira superzavojnica, a najsporije otvoreni krug (relaksirana DNA)
linearni plazmidi u gelu putuju otprilike jednako brzo kao i nikirani plazmidi
velike plazmide (veće od 10 kb) teško je izolirati u obliku superzavojnice
primjena elektroforeze DNA
Dijagnostička elektroforeza - provjera bilo kojeg koraka tijekom kloniranja (vježbe)
* provjera uspješnosti izolacije ili umnažanja plazmida (DNA)
* provjera kvalitete DNA (degradacija, prisutnost nukleaza, prisutnost RNA…)
* provjera uspješnosti restrikcije, ligacije…
* provjera konstrukcije plazmida (duljina i orijentacija inserta…)
* restrikcijska analiza (provjera strukture DNA; izrada restrikcijske mape)
Preparativna elektroforeza - izolacija željenog fragmenta DNA iz gela
kako znamo da plazmid nije pocijepan
bend najvećeg intenziteta je onaj koji je najniže i vide se bendovi slabijeg intenziteta iznad njega, da je prikazan pocijepani plazmid, bend najvećeg intenziteta bi bio najviši, tj. najsporiji i bili bi drugi bendovi ispod njega
kako provjeravamo uspješnost restrikcije
u pozadini ne smije biti razmaza, tj. smearova jer to ukazuje da je uzorak kontaminiran npr. egzonukleazom ili malom količinom genomske DNA koju smo izolirali skupa s plazmidom
kako provjeravamo uspješnost kloniranja
konstruirani plazmid pocijepamo na dva mjesta tako da se insert može izolirati te gledamo vidi li se taj insert na rezultatima elektroforeze
za što koristimo restrikcijsku mapu
za planiranje kloniranja, insilico kloniranje
kako određujemo veličinu nepoznatog fragmenta DNA
Veće molekule migriraju sporije, a manje brže
brzina migriranja: V=K∙1/logL (vrijedi samo za linearne dvolančane mol.)
Veličina nepoznatog fragmenta određuje se na osnovi usporedbe sa standardom (molekule poznate veličine)
Brzina migracije ovisi o nizu parametara pa elektroforezu nepoznatog fragmenta i standarda treba provesti na istom gelu
čija DNA se najčešće koristi kao standard
DNA bakteriofaga lambda pocijepana s nukleazom HindIII
kako se konstruira graf za određiavnje vel. fragmenata
na x os ide L - duljina puta koji je fragment prošao u gelu
na y os ide log pb - log od duljine fragmenata DNA standarda u pb
kako određujemo masu (konc.) DNA
na temelju usporedbe intenziteta vrpce (“band-a”) s intenzitetom vrpce u kojoj se nalazi poznata masa DNA (standard)
(u 1 μL može biti od nekoliko ng do nekoliko μg DNA)
objasni elektroforezu u pulsirajućem el. polju
koristi se za razdvajanje velikih molekula DNA (20 kb do 5 Mb)
prvo je potrebno izolirati DNA - velike molekule lako pucaju tijekom manipulacije (pipetiranje, centrifugiranje); DNA se izolira iz stanica koje su imobilizirane u blokićima agaroznog gela; u jažicu se stavlja dio agaroznog blokića i “zalije” agarozom
Elektroforeza - DNA se izlaže promjenama smjera električnog polja
- ponekad traje i više od 48 sati
- potrebno je hlađenje pufera na određenu temperaturu
- zamjena i cirkulacija pufera pomoću pumpe
- jako kvalitetna agaroza
nabroji neke izvedbe pulsirajuće elektroforeze
FIGE, TAFE, RGE, CHEF
nabroji neke izvedbe preparativne elektroforeze
Pomoću DEAE-membrane (dietil aminoetil)
Elektroelucijom
Ekstrakcija DNA iz agaroznog gela niskog tališta (LMP-agaroza)
Adsorpcija na staklene kuglice
objasni elektroforezu pomoću DEAE-membrane (dietil aminoetil)
membranu postaviti u gel neposredno ispred vrpce koju treba izolirati (iz gela se izreže kocka, postavi membrana i kocka vrati natrag); nastaviti elektroforezu dok se DNA ne veže na membranu; membranu izvaditi iz gela, isprati otopinom niske ionske jakosti te DNA eluirati otopinom visoke ionske jakost
što je to elektroelucija
izrezati dio gela koji sadrži željenu vrpcu i staviti u vrećicu za dijalizu
vrećicu s gelom vratiti u uređaj za elektroforezu da DNA izađe iz gela i zaustavi se na stijenci vrećice
iz pufera istaložiti DNA
objasni ekstrakciju DNA iz agaroznog gela niskog tališta
elektroforezu provesti u LMP-agarozi
izrezati dio gela koji sadrži željenu vrpcu, dodati pufer te gel otopiti zagrijavanjem 65°C
iz otopine pročistiti DNA (agar se ukloni ekstrakcijom s fenolom, a DNA istaloži etanolom); agar se može ukoniti i pomoću agaraze
objasni adsorpciju na staklene kuglice
agarozu otopiti u NaI
DNA se veže na staklene kuglice s kojih se kasnije eluira
