restrikcijski enzimi Flashcards
kakav je sastav DNA
Šećer - deoksiriboza
Nukleinska baza - adenin, timin, gvanin, citozin
Fosfat - fosfodiesterska veza
Deoksiribonukleozid
Deoksiribonukleotid
Polinukleotid
RNA - riboza; uracil umjesto timina
kakva je komplementarnost DNA
Dva komplementarna lanca
sastav jednog lanca određuje sastav drugog lanca
na osnovi jednog lanca može se sintetizirati drugi lanac
replikacija DNA
kakva je polarnost DNA
Dva komplementarna lanca
međusobno su antiparalelna
komplementarni lanci su suprotne polarnosti
5’-kraj – fosfatna skupna
3’-kraj – OH skupina
što radi DNA polimeraza
zadužena je za sintezu DNA
što su restrikcijske endonukleaze
neophodan „alat” u genetičkom inženjerstvu
omogućavaju nam da fragmentiramo/režemo/cijepamo/presijecamo dsDNA – „restrikcija”
„molekularne škare za dsDNA”
odakle potječu restrikcijske endonukleaze
potječu iz bakterija – dio su restrikcijsko-modifikacijskih sustava (RM-sustavi) kojim se bakterije štite od bakteriofaga i strane DNA
* cijepaju stranu DNA – restrikcija
* vlastitu DNA štite od restrikcije metilacijom baza - modifikacija
RM-sustavi?
Otkriveni su u eksperimentima infekcije bakterije E. coli fagom lambda
Eksperiment (infekcija dva soja E. coli fagom lambda):
pripremljene su dvije suspenzije faga lambda, jedna infekcijom soja K, a druga infekcijom soja B
obje suspenzije faga korištene su za infekciju oba soja E. coli
uspješnost infekcije izražena je kao titar faga
koje vrste odgovora RM-sustava na prepoznate sekvencije postoje?
ako je prepoznata sekvencija:
* nemetilirana – restrikcija
* hemimetilirana – metilacija
* metilirana – nema aktivnosti
koji je najbolji supstrat za modifikacijsku metilazu
hemimetilirana DNA
koje skupine restrikcijskih endonukleaza postoje
podijeljene u nekoliko skupina (I, II, IIS, III i IV)
metilacija?
metilacija kasni za replikacijom DNA
* uloga metilacije DNA u inicijaciji replikacije DNA i postreplikativnom popravku DNA
objasni restrikcijske endonukleaze skupine II
najveću primjenu imaju restrikcijske endonukleaze skupine II:
„restrikcijski enzimi” u genetičkom inženjerstvu, mol.gen., mol.biol…
cijepaju dsDNA unutar specifične simetrične sekvencije
* najčešće „palindromske sekvencije” duljine 4 i 6, rjeđe 8 pb
što su palindromi u mol. DNA
Komplementarni lanci, u smjeru iste polarnosti, imaju isti redoslijed nukleotida
što imaju palindromi
Imaju os simetrije - ako palindromsku sekvenciju “okrenemo” za 180° redoslijed nukleotida ostaje nepromijenjen
Susjedne baze (u istom lancu DNA) u centru palindroma uvijek su međusobno komplementarne (AT, TA, GC, CG); dvije baze koje su jednako udaljene od centra palindroma uvijek su komplementarne
kako restrikcijski enzimi mogu cijepati DNA
Ostavljaju 5’-jednolančane krajeve
Ostavljaju 3’-jednolančane krajeve
Ostavljaju “ravne” krajeve
što su izoshizomeri
to su različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju, cijepaju iste sekvencije, ali ostaju različito istureni krajevi
što su striktni izoshizomeri
to su različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju na isti način
dolazi li do ligiranja fragmenata DNA koji su nastali restrikcijskim enzimima
samo ako fragmenti imaju ravne krajeve ili fragmenti imaju kompatibilne (“ljepljive”) krajeve
što je religacija
ponovno spajanje fragmenata nastalih restrikcijskim enzimom, uzrokuje obnavljanje restrikcijskog mjesta
objasni rekombinaciju in vitro
cijepanjem restrikcijskim enzimom nastaju fragmenti, nje zaokrećemo tako da se mogu ponovno spojiti s drugim fragmentima, bitno je paziti na polarnost lanaca, nekad se fragmenti mogu tako posložiti da se izgubi sekvenca koju prepoznaje restrikcijski enzim
kakva može biti orijentacija inserta u vektoru
ovisno o orijentaciji inserta, on može u vektoru biti na dva načina
objasni restrikcijske enzime (skupina II)
Komercijalno dostupno više od 600 različitih restrikcijskih enzima
Cijena - razlika u cijeni između pojedinih restrikcijskih enzima može biti i više od 1.000x
- oni koji su „klonirani” u E.coli su puno jeftiniji
Čuvaju se na -20°C u glicerolu, a na sobnoj temperaturi uglavnom brzo gube aktivnost
koji su najpoznatiji proizvođači restrikcijskih enzima
New England Biolabs
Roche
Fermentas
kako se nabavljaju restrikcijski enzimi
s odgovarajućim puferima (najčešće 10 puta koncentrirani) pH, Mg2+; monovalentni kationi; reducens (stabilnost enzima)
* pH obično 7 do 9; Tris-HCl (10 mM)
koja je optimalna temperatura za restrikcijske enzime
najčešće 37°C (25-65°C), u pravilu je 37°C, to je i za bakterije, ali postoje enzimi koji imaju opt. temp. i na nižim i na višim temp.
što je aktivnost
jedna jedinica (“unit”, U) dovoljna je za potpuno cijepanje 1 μg DNA bakteriofaga lambda pri optimalnim uvjetima u volumenu od 50 μl, u periodu od jednog sata
kakva je aktivnost restrikcijskih enzima s obzirom na udaljenost od kraja dsDNA
može se dogoditi da neki restik. enzim uopće neće pocijepati DNA u odgovarajućoj sekvenci, jer se ta sekvenca nalazi pri kraju dsDNA
kako ide postupak transformacije s restrikcijskim enzimom
1) imamo plazmid i dodamo restrikcijski enzim (npr. EcoRI), plazmid pocijepamo tim enzimom
2) izoliramo DNA koju želimo umetnuti u vektor
3) pomiješamo insert, vektor i DNA-ligazu
koji problem nastaje kad su DNA-ligaza i restrikcijski enzim oboje prisutni
DNA- ligaza spaja krajeve, a restrikcijski enzim ih uporno cijepa, zato se restrikcijski enzim treba ukloniti
kako se sprječavaju neželjene restrikcije
inaktivacijom restrikcijskog enzima
* 20-30 minuta na 60-70°C (samo ako su termolabilni (uglavnom jesu))
* dodatak EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina) (helira Mg2+ - inaktivira i druge enzime (npr DNA-ligazu))
sprječavanjem kontakta DNA i enzima – fizičkim razdvjanjem DNA i enzima
* ekstrakcija s fenol/kloroform/izoamilni alkohol
* elektroforeza i izolacija DNA iz gela (vježbe)
* taloženje DNA (vježbe)
o čemu ovisi učestalost pojave restrikcijskih mjesta u DNA
ovisi o utjecaju AT/GC-sastava DNA
