restrikcijski enzimi

Question 1

kakav je sastav DNA

Answer 1

Šećer - deoksiriboza
Nukleinska baza - adenin, timin, gvanin, citozin
Fosfat - fosfodiesterska veza
Deoksiribonukleozid
Deoksiribonukleotid
Polinukleotid
RNA - riboza; uracil umjesto timina

Question 2

kakva je komplementarnost DNA

Answer 2

Dva komplementarna lanca
sastav jednog lanca određuje sastav drugog lanca
na osnovi jednog lanca može se sintetizirati drugi lanac
replikacija DNA

Question 3

kakva je polarnost DNA

Answer 3

Dva komplementarna lanca
međusobno su antiparalelna
komplementarni lanci su suprotne polarnosti
5’-kraj – fosfatna skupna
3’-kraj – OH skupina

Question 4

što radi DNA polimeraza

Answer 4

zadužena je za sintezu DNA

Question 5

što su restrikcijske endonukleaze

Answer 5

neophodan „alat” u genetičkom inženjerstvu
omogućavaju nam da fragmentiramo/režemo/cijepamo/presijecamo dsDNA – „restrikcija”
„molekularne škare za dsDNA”

Question 6

odakle potječu restrikcijske endonukleaze

Answer 6

potječu iz bakterija – dio su restrikcijsko-modifikacijskih sustava (RM-sustavi) kojim se bakterije štite od bakteriofaga i strane DNA
* cijepaju stranu DNA – restrikcija
* vlastitu DNA štite od restrikcije metilacijom baza - modifikacija

Question 7

RM-sustavi?

Answer 7

Otkriveni su u eksperimentima infekcije bakterije E. coli fagom lambda
Eksperiment (infekcija dva soja E. coli fagom lambda):
pripremljene su dvije suspenzije faga lambda, jedna infekcijom soja K, a druga infekcijom soja B
obje suspenzije faga korištene su za infekciju oba soja E. coli
uspješnost infekcije izražena je kao titar faga

Question 8

koje vrste odgovora RM-sustava na prepoznate sekvencije postoje?

Answer 8

ako je prepoznata sekvencija:
* nemetilirana – restrikcija
* hemimetilirana – metilacija
* metilirana – nema aktivnosti

Question 9

koji je najbolji supstrat za modifikacijsku metilazu

Answer 9

hemimetilirana DNA

Question 10

koje skupine restrikcijskih endonukleaza postoje

Answer 10

podijeljene u nekoliko skupina (I, II, IIS, III i IV)

Question 11

metilacija?

Answer 11

metilacija kasni za replikacijom DNA
* uloga metilacije DNA u inicijaciji replikacije DNA i postreplikativnom popravku DNA

Question 12

objasni restrikcijske endonukleaze skupine II

Answer 12

najveću primjenu imaju restrikcijske endonukleaze skupine II:
„restrikcijski enzimi” u genetičkom inženjerstvu, mol.gen., mol.biol…
cijepaju dsDNA unutar specifične simetrične sekvencije
* najčešće „palindromske sekvencije” duljine 4 i 6, rjeđe 8 pb

Question 13

što su palindromi u mol. DNA

Answer 13

Komplementarni lanci, u smjeru iste polarnosti, imaju isti redoslijed nukleotida

Question 14

što imaju palindromi

Answer 14

Imaju os simetrije - ako palindromsku sekvenciju “okrenemo” za 180° redoslijed nukleotida ostaje nepromijenjen
Susjedne baze (u istom lancu DNA) u centru palindroma uvijek su međusobno komplementarne (AT, TA, GC, CG); dvije baze koje su jednako udaljene od centra palindroma uvijek su komplementarne

Question 15

kako restrikcijski enzimi mogu cijepati DNA

Answer 15

Ostavljaju 5’-jednolančane krajeve
Ostavljaju 3’-jednolančane krajeve
Ostavljaju “ravne” krajeve

Question 16

što su izoshizomeri

Answer 16

to su različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju, cijepaju iste sekvencije, ali ostaju različito istureni krajevi

Question 17

što su striktni izoshizomeri

Answer 17

to su različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju na isti način

Question 18

dolazi li do ligiranja fragmenata DNA koji su nastali restrikcijskim enzimima

Answer 18

samo ako fragmenti imaju ravne krajeve ili fragmenti imaju kompatibilne (“ljepljive”) krajeve

Question 19

što je religacija

Answer 19

ponovno spajanje fragmenata nastalih restrikcijskim enzimom, uzrokuje obnavljanje restrikcijskog mjesta

Question 20

objasni rekombinaciju in vitro

Answer 20

cijepanjem restrikcijskim enzimom nastaju fragmenti, nje zaokrećemo tako da se mogu ponovno spojiti s drugim fragmentima, bitno je paziti na polarnost lanaca, nekad se fragmenti mogu tako posložiti da se izgubi sekvenca koju prepoznaje restrikcijski enzim

Question 21

kakva može biti orijentacija inserta u vektoru

Answer 21

ovisno o orijentaciji inserta, on može u vektoru biti na dva načina

Question 22

objasni restrikcijske enzime (skupina II)

Answer 22

Komercijalno dostupno više od 600 različitih restrikcijskih enzima
Cijena - razlika u cijeni između pojedinih restrikcijskih enzima može biti i više od 1.000x
- oni koji su „klonirani” u E.coli su puno jeftiniji
Čuvaju se na -20°C u glicerolu, a na sobnoj temperaturi uglavnom brzo gube aktivnost

Question 23

koji su najpoznatiji proizvođači restrikcijskih enzima

Answer 23

New England Biolabs
Roche
Fermentas

Question 24

kako se nabavljaju restrikcijski enzimi

Answer 24

s odgovarajućim puferima (najčešće 10 puta koncentrirani) pH, Mg2+; monovalentni kationi; reducens (stabilnost enzima)
* pH obično 7 do 9; Tris-HCl (10 mM)

Question 25

koja je optimalna temperatura za restrikcijske enzime

Answer 25

najčešće 37°C (25-65°C), u pravilu je 37°C, to je i za bakterije, ali postoje enzimi koji imaju opt. temp. i na nižim i na višim temp.

Question 26

što je aktivnost

Answer 26

jedna jedinica (“unit”, U) dovoljna je za potpuno cijepanje 1 μg DNA bakteriofaga lambda pri optimalnim uvjetima u volumenu od 50 μl, u periodu od jednog sata

Question 27

kakva je aktivnost restrikcijskih enzima s obzirom na udaljenost od kraja dsDNA

Answer 27

može se dogoditi da neki restik. enzim uopće neće pocijepati DNA u odgovarajućoj sekvenci, jer se ta sekvenca nalazi pri kraju dsDNA

Question 28

kako ide postupak transformacije s restrikcijskim enzimom

Answer 28

1) imamo plazmid i dodamo restrikcijski enzim (npr. EcoRI), plazmid pocijepamo tim enzimom
2) izoliramo DNA koju želimo umetnuti u vektor
3) pomiješamo insert, vektor i DNA-ligazu

Question 29

koji problem nastaje kad su DNA-ligaza i restrikcijski enzim oboje prisutni

Answer 29

DNA- ligaza spaja krajeve, a restrikcijski enzim ih uporno cijepa, zato se restrikcijski enzim treba ukloniti

Question 30

kako se sprječavaju neželjene restrikcije

Answer 30

inaktivacijom restrikcijskog enzima
* 20-30 minuta na 60-70°C (samo ako su termolabilni (uglavnom jesu))
* dodatak EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina) (helira Mg2+ - inaktivira i druge enzime (npr DNA-ligazu))
sprječavanjem kontakta DNA i enzima – fizičkim razdvjanjem DNA i enzima
* ekstrakcija s fenol/kloroform/izoamilni alkohol
* elektroforeza i izolacija DNA iz gela (vježbe)
* taloženje DNA (vježbe)

Question 31

o čemu ovisi učestalost pojave restrikcijskih mjesta u DNA

Answer 31

ovisi o utjecaju AT/GC-sastava DNA