PCR, qPCR, RAPD

Question 1

objasni PCR

Answer 1

Lančana reakcija polimerazom
Termorezistentne DNA-polimeraze - Taq (Thermus aquaticus); Tfl, Pfu, Vent . . .
Primjena - umnažanje (detekciju) točno određenog dijela genoma (DNA) iz male količine genetičkog materijala (teoretski dovoljna samo jedna dvolančana molekula)
- detekcija RNA moguća je uz upotrebu reverzme transkriptaze

Question 2

objasni princip PCR-a

Answer 2

potrbne su dvije klice, oligonukleotida (eng. “primer”, početnice, začetnice) - 12-30 nukleotida (jednolančana DNA); komplementarno se sparuju „lijevo i desno” od dijela DNA kojeg želimo umnožiti; 3’-krajevi klica moraju biti orijentirani jedan prema drugome

Question 3

koji su koraci kod PCR-a

Answer 3

1. prvo se DNA treba denaturirati zagrijavanjem na 94-95°C
2. početnice se komplementarno sparuju s jednolanč. DNA, to se odvija na 50-65°C
3. temp. se podiže na 70-72°C jer je to optimalna temp. za termorezistentne polimeraze, kreće sinteza Dna i dobijemo dijelomice dvolanč. DNA

Question 4

koliko mol. DNA dobijemo nakon 3. ciklusa PCR-a ako krećemo od jedne mol. DNA

Answer 4

8 mol., dvije su one koje mi želimo, koje kreću 5’-krajem jedne početnice i završavaju 5’-krajem druge

Question 5

koja je formula za izračun broja dvolančanih DNA nakon n broja ciklusa

Answer 5

M = M0 x 2^n
M= konačni broj dvolančanih molekula DNA nakon n ciklusa
M0 = početni broj molekula
N = broj ciklusa

Question 6

koji je sastav reakcijske otopine

Answer 6

DNA-kalup
početnice (1 pM/μL)
dNTP-ovi (200 pM/μL)
polimeraza (1-5 U)
pufer za polimerazu, Mg2+ (1x)

Question 7

koji su uvjeti reakcije

Answer 7

početna denaturacija DNA – 5 min, 94-95°C
denaturacija DNA – 30 s, 94-95°C
komplementarno sparivanje početnica (“annealing”) – 50-65°C (5-20°C ispod Tm), 1 min
sinteza DNA – 70-72°C, vrijeme ovisi o duljini fragmenta (~1min/kb)
završna sinteza DNA – 10 min

Question 8

koji se problemi mogu javiti kod PCR-a

Answer 8

prijenos topline s “termo bloka” na otopinu u kiveti ovisi o uređaju, kiveti, volumenu uzorka - rješenje su kapilarni uređaji, imaju brži prijenos topilne
pojava “parazitskih bandova” - nespecifično započinjanje reakcije - rješenje je da se polimeraza dodaje tek nakon početnog zagrijavanja ili “hot start”-polimeraze koje se aktiviraju tek kada prvi put temp. poraste do 94-95°C
Taq polimeraza ima nisku vjernost replikacije (uvodi mutacije) - rješenje je da se koriste termorezistentne polimeraze s lektorirajućom 3’→ 5’ egzonukleaznomaktivnošću
rutinski se umnažaju kratki fragmeti (do maksimalne duljine od 2 do 3 kb) - za umnažanje fragmenata duljih od 2 do 3 kb koriste se posebne DNA-polimeraze - procesivne dna-pol koje se vežu na 3’-kraj i jako dugo sintetiziraju, ne otpuštaju se s DNA

Question 9

Može li se na temelju intenziteta vrpce umnožene PCRom odrediti količina (broj molekula DNA) koje su korištene kao kalup za PCR

Answer 9

može, možemo odrediti masu DNA iz intenziteta i veličina fragmenta (usporedba sa standardom) te se iz tih podataka može odrediti početni broj mol DNA

Question 10

kako očitavamo rezultate PCR-a

Answer 10

možemo ih očitati na gelu (elektroforeza)

Question 11

objasni real-time PCR i quantitative PCR

Answer 11

Primjena – određivanje udjela pojedinih molekula DNA u nekom uzorku – između ostalog, omogućava određivanje udjela GMO u nekom proizvodu, udjela nekog mikroorganizma u mješovitoj populaciji itd
Princip: praćenje umnažanja DNA u realnom vremenu na temelju povećanja fluorescencije; najčešće se koristi metoda TaqMan

Question 12

objasni TaqMan metodu

Answer 12

u otopinu se uz sve navedeno za obični PCR dodaje i TaqMan sonda, ona se sparuje s jednim lancem kalupa, …, uređaj zabilježi fluorescenciju tek kad R nije više blizu Q, nakon 2. ciklusa imamo 3 signala fluorescencije, jedan nastao nakon 1. ciklusa, druga dva nakon 2. ciklusa
(tu mi fale još objašnjenja, nisam ga polovila kaj je pričal)

Question 13

što je TaqMan sonda

Answer 13

sekveca jednolanč. DNA koja ima fluorescentne jedinice R i Q, one daju različite intenzitete, kad su blizu jedna drugoj R se ne vidi jer ju Q prigušuje

Question 14

kako ovisi kritična vrijednost fluorescencije o količini DNA

Answer 14

što je početna količina DNA veća, ranije se postigne kritična vrijednost fluorescencije

Question 15

koja je primjena TaqMan metode

Answer 15

koristi se za određivanje udjela GMO, pomoću nje se može teoretski odrediti koliko je bilo npr. virusnih čestica u poč. uzorku

Question 16

objasni RAPD-PCR

Answer 16

“Randomly Amplified Polimorphic DNA”
Slučajno umnožena polimorfna DNA (pojavljuje se u više oblika)
Osniva se na metodi PCR

Question 17

koji je princip RAPD-PCR

Answer 17

PCR se provodi pri uvjetima koji omogućuju da se početnice vežu na više mjesta (manje specifično sparivanje početnice i kalupa)
- kraće početnice (veća vjerojatnost sparivanja)
- sparivanje početnice i kalupa provodi se pri znatno nižoj temperaturi (manja specifičnost kompl. sparivanja)
- veća koncentracija Mg2+
može se koristiti samo jedna ili više početnica

Question 18

elektroforeza RAPD

Answer 18

brzo, jeftino, informativno uspoređivanje sojeva/uzoraka DNA
tražimo na gelu onaj uzorak koji je jednak prvim uzorcima???