enzimi u gi Flashcards
u koje dvije skupine dijelimo enzime koji se koriste u gi
u restrikcijske enzime i modifikacijske enzime (sve osim restrikcijskih enzima)
što su DNA-ligaze
enzimi koji stvaraju fosfodiesterske veze u molekuli DNA između 5’-fosfatne i 3’-hidroksilne skupine
za što se upotrjebljuju DNA-ligaze u gi
najčešće ligacija vektora i inserta
-povezivanje linearnih molekula DNA
-cirkularizacija linearnih molekula DNA
-ligacija jednolančanih lomova (“nickova”)
koji su supstrati DNA-ligaze
-dvolančana DNA s jednolančanim lomovima (“nick”) – najbolji supstrat
-molekule DNA s kompatibilnim (kohezivnim, “ljepljivim”) krajevima
-molekule DNA s ravnim (“blunt”) – samo neke (manje uspješno)
nabroji neke primjere DNA-ligaze
T4 DNA-ligaza - komercijalno najvažnija; iz bakteriofaga T4; koristi ATP kao koenzim; ligira ljepljive i ravne krajeve DNA
DNA-ligaza iz E. coli - kao koenzim koristi NAD+; ne može ligirati ravne krajeve
objasni kloniranje HindIII-HindIII fragmenta bakteriofaga lambda
- DNA faga pocijepati s HindIII
- plazmid pocijepati s HindIII
- elektroforeza
- fragment DNA faga izolirati iz gela (insert)
- plazmid izolirati iz gela (vektor)
- provjeriti uspješnost izolacije DNA
- ligacija vektora i inserta
- transformacija E. coli
- provjera transformanata (izolacija i analiza plazmida)
koji se problemi mogu pojaviti kod kloniranja fragmenta bakteriofaga lambda
- veća je vjerojatnost religacije vektora
nego ligacije vektora i inserta, religacija se može spriječiti dodatkom polinukleotid fosfataze koja uklanja fosfatnu skupinu s vektora, nju moramo i ukloniti jer inače može doći i do uklanjanja fosfatne skupine s inserta, nju uklanjamo denaturacijom enzima ili taloženjem DNA - ligacijom može nastati puno različitih
kružnih i linearnih molekula DNA - može se dogoditi da dobijemo transformante s praznim vektorima tj. vektore bez inserta
što je knjižnica gena
skup klonova (najčešće bakterije E.coli ili kvasca S.cerevisiae) koji sadrže vektore (najčešće plazmide ili umjetne kromosme) u kojma su klonirani (ugrađeni, insertirani) svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma (npr. čovjeka) – u jednom klonu u pravilu se nalazi jedan fragment genoma
što je cDNA banka
sadrži kodirajuću DNA (ORFove) nekog organizma
što je genomska banka
sadrži kodirajuću i nekodirajuću DNA
nabroji ostale enzime koji se koriste u gi
Ribonukleaze (RNaze) - RNaza A, RNaza H
DNaze - S1, Bal 31, DNaza I, egzonukleaza III
DNA-polimeraze - DNA-polimeraza I, Klenow fragment, Taq, reverzna transkriptaza
Polinukleotid fosfataza
Polinukleotid kinaza
Terminalna deoksinukleotidil transferaza
RNA-polimeraze
objasni RNazu A
endoribonukleaza - cijepa unutar lanca (izolirana iz goveđeg pankreasa)
aktivnost - cijepa fosfodiestersku vezu u jednolančanoj RNA ostavljajući 3’- fosfatnu grupu na pirimidinskim nukleotidima
primjena - uklanjanje RNA pri izolaciji plazmidne ili genomske DNA
objasni RNazu H
izolirana iz bakterije E. coli
aktivnost - cijepa RNA do kratkih oligoribonukleotida i to samo ako se RNA nalazi u DNA/RNA-hibridu
- ne hidrolizira fosfodiesterske veze u ssDNA, dsDNA, ssRNA i dsRNA
primjena - priprema cDNA
objasni nukleazu S1
izolirana iz plijesni Aspergillus oryzae
aktivnost - hidrolizira i jednolančanu DNA i jednolančanu RNA do 5’-fosforil mono- ili
oligonukleitida, ali:
* ima 5x veću aktivnost na DNA nego na RNA
* ako se nalazi u velikom suvišku hidrolizira i dsDNA
* najslabiju aktivnost ima na DNA/RNA-hibridu
- aktivna je pri niskom pH (4,5) i u prisutnosti Zn2+
primjena - uklanjanje jednolančane DNA s krajeva dvolančanih fragmenata
- S1-mapiranje
što je S1 mapiranje
to je metoda koja se koristi za određivanje broja i duljine egzona nekom genu
kako se vrši S1 mapiranje
- mRNA se pomiješa s denaturiraom ili jednolančanom DNA - mRNA se komplementano sparuje s odgovarajućim genom (DNA)
- otopina koja sadrži RNA/DNA hibrid tretira se nukleazom S1
- u smjesi zaostaje samo DNA/RNA-hibrid - elektroforeza (broj i veličina fragmenata); fragmenti su zapravo egzon
- kloniranje egzona
- prevođenje RNA/DNA hibrida u dsDNA - tretiranje RNazom H i sinteza komplementarnog lanca DNA
- insercija dsDNA u vektor
- transformacija E.coli
- izolacija plazmida
- sekvencioniranje inserta
objasni nukleazu BAL 31
aktivnost - hidrolizira DNA do 5’-fosforil-mononukleotida
- egzonukleazna aktivnost prema dsDNA (hidrolizira 5’- i 3’-kraj, skraćuje dsDNA)
- ostavlja ravne krajeve
primjena - skraćivanje dsDNA sa njenih krajeva, npr. detekcija promotora
objasni DNazu 1
izolirana iz goveđeg pankreasa
aktivnost - endonukleaza koja hidrolizira jednolančanu i dvolančanu DNA ostavljajući fosfatnu skupinu na 5’-kraju
- aktivnost joj ovisi o prisutnosti Ca2+, a može se modulirati prisustvom Mg2+ (MgCl2) i Mn2+ (MnCl2)
* Mg2+ - nasumice uvodi jednolančane lomove
* Mn2+ - nasumično uvodi dvolančane lomove (djeluje kao nespecifični restrikcijski enzim)
koja je primjena DNaze 1
u prisustvu Mn2+ - fragmentiranje dsDNA (priprema knjižnice gena)
u prisustvu Mg2+ - uvođenje jednolančanih lomova (supstrat za DNA-polimerazu I) - obilježavanje DNA (radioaktivno ili neradioaktivno)
- u velikim koncentracijama potpuno hidrolizira DNA - primjena pri izolaciji RNA; uklanjanje kalupa nakon in vitro transkripcije
- istraživanje interakcije DNA i proteina (“DNaze I footprinting”) - mogu se detektirati sekvencije DNA na koje se veže određeni protein jer DNaza ne može razgraditi DNA na koju je protein vezan; DNaza I doda se u otopinu DNA i odgovarajućeg proteina
kako rade DNaza I i DNA-pol I
imamo jednolanč. lom koji prepoznaje DNA-pol I, ona svojom 5’-3’ pol. aktivnošću sintetizira nove nukleotide; dolazi do pomaka loma gdje se lom zapravo premjestio na drugi kraj
objasni egzonukleazu III
izolirana iz bakterije E. coli
enzimska aktivnost: 3’-5’-egzonukleaza na dsDNA
aktivna je na: - jednolančanim lomovima
- ravnim krajevima
- isturenim jednolančanim krajevima, ali:
* nije aktivna na 3’-isturenim krajevima duljim od 3 nukleotida ni ss DNA
koja je primjena egzonukleaze III
skraćivanje linearnih fragmenata dsDNA na samo jednom kraju - restrikcija, egzonukleaza III, nukleaza S1
priprema (dobivanje) jednolančane kružne DNA - Nb.Bpu10I (Fermentas) i egzonukleaza III
objasni DNA-pol I
izolirana iz bakterije E. coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza - za sintezu potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTP-ovi i Mg2+
koje sve aktivnosti ima DNA-pol I
- 5’-3’-polimerazna aktivnost
- 3’-5’-nukleazna aktivnost (“proofreading”, lektorirajuća aktivnost) - stimulirana zadnjim nesparenim nukleotidom na 3’-kraju
- 5’-3’-nukleazna aktivnost (na jednolančanim lomovima) - produljuje 3’-kraj i degradira 5’-kraj (“nick-translation”)
- ribonukleazna aktivnost (slično kao RNaza H)
objasni Klenow fragment
C-terminalni dio (~70%) ima 5’-3’-polimeraznu i 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost – Klenow fragment (Klenow-polimeraza; Klenow enzim)
- 5’-3’-nukleazna aktivnost je nepoželjna u mnogim metodama GI
- 3’-5’-nukleazna lektorirajuća aktivnost je poželjna jer povećava vjernost sinteze DNA
- nema 5’-3’-nukleaznu aktivnost
koja je primjena DNA pol I i Klenowog fragmenta
- mogu koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
- primjena – označavanje DNA
objasni Taq polimerazu
izolirana iz Thermus aquaticus; rekombinantna iz E.coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza (za sintezu su potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTP-ovi i Mg2+)
aktivnosti - ima 5’-3’ polimeraznu aktivnost
- nema 3’-5’ egzonukleaznu aktivnost
- ima jako slabu 5’-3’-egzonuklezanu
- ostavlja 3’-istureni dA na 3’-kraju
termostabilna - vrijeme “poluživota” na 95°C je više od 40 minuta
može koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
primjena - “Polymerase Chain Reaction” (PCR) – lančana reakcija polimerazom
- AT-kloniranje - koristi se linearni vektor koji ima istureni T na 3’-kraju
objasni reverznu transkriptazu
RNA-ovisna DNA-polimeraza - polimerizira DNA na kalupu RNA
izolirana iz retrovirusa; modificirana i klonirana u E.coli
upotreba – konstrukcija cDNA biblioteka
- izoliranu RNA propustiti kroz kolonu koja sadrži oligo-dT (veže se samo mRNA jer
sadrži poliA) te mRNA eluirati s 0,1 M NaCl
- dodati oligo-dT i reverznu transkriptazu – DNA/RNA-hibrid
- dodati RNazu H, DNA-polimerazu I, dNTPove
- stvaranje ravnih krajeva, ligacija i ligacija s vektorom
koje su upotrebe DNA-polimeraza i DNaza u GI
- sinteza DNA prema kalupu (obilježavanje DNA – kemijski modificirani i radioaktivni nukleotidi) (DNA-pol I, Klenow frag, Taq)
- pretvaranje 5’- i 3’-krajeva u ravne krajeve (nukleaza S1, DNA-pol I)
- PCR – termostabilne polimeraze
- cDNA – reverzna transkriptaza
objasni polinukleotid fosfatazu
uklanja fosfatnu grupu s 5’-kraja ss i ds DNA i RNA
objasni polinukleotid kinazu
katalizira prijenos gama fosfata s ATP na 5’-OH skupinu ss i ds RNA i DNA
objasni terminalnu deoksinukleotidil transferazu
izolirana iz goveđeg timusa
aktivnost - polimerizira deoksinukleotide na slobodnu 3’-OH skupinu ss i dsDNA
upotreba - obilježavanje DNA na 3’-kraju
- izrada knjižnica gena (npr: fragmentiranje genoma s DNazom I, na fragmente se doda poli-dA, a na linearizirane plazmide poli-dT . . .)
objsani RNA-polimeraze
Koriste se za in vitro sintezu RNA ili obilježene RNA - RNA polimeraze virusa SP6, T7, T3
