Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

geneticko inz > enzimi u gi > Flashcards

enzimi u gi Flashcards

1
Q

u koje dvije skupine dijelimo enzime koji se koriste u gi

A

u restrikcijske enzime i modifikacijske enzime (sve osim restrikcijskih enzima)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

što su DNA-ligaze

A

enzimi koji stvaraju fosfodiesterske veze u molekuli DNA između 5’-fosfatne i 3’-hidroksilne skupine

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

za što se upotrjebljuju DNA-ligaze u gi

A

najčešće ligacija vektora i inserta
-povezivanje linearnih molekula DNA
-cirkularizacija linearnih molekula DNA
-ligacija jednolančanih lomova (“nickova”)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

koji su supstrati DNA-ligaze

A

-dvolančana DNA s jednolančanim lomovima (“nick”) – najbolji supstrat
-molekule DNA s kompatibilnim (kohezivnim, “ljepljivim”) krajevima
-molekule DNA s ravnim (“blunt”) – samo neke (manje uspješno)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

nabroji neke primjere DNA-ligaze

A

T4 DNA-ligaza - komercijalno najvažnija; iz bakteriofaga T4; koristi ATP kao koenzim; ligira ljepljive i ravne krajeve DNA
DNA-ligaza iz E. coli - kao koenzim koristi NAD+; ne može ligirati ravne krajeve

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

objasni kloniranje HindIII-HindIII fragmenta bakteriofaga lambda

A
  1. DNA faga pocijepati s HindIII
  2. plazmid pocijepati s HindIII
  3. elektroforeza
  4. fragment DNA faga izolirati iz gela (insert)
  5. plazmid izolirati iz gela (vektor)
  6. provjeriti uspješnost izolacije DNA
  7. ligacija vektora i inserta
  8. transformacija E. coli
  9. provjera transformanata (izolacija i analiza plazmida)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

koji se problemi mogu pojaviti kod kloniranja fragmenta bakteriofaga lambda

A
  • veća je vjerojatnost religacije vektora
    nego ligacije vektora i inserta, religacija se može spriječiti dodatkom polinukleotid fosfataze koja uklanja fosfatnu skupinu s vektora, nju moramo i ukloniti jer inače može doći i do uklanjanja fosfatne skupine s inserta, nju uklanjamo denaturacijom enzima ili taloženjem DNA
  • ligacijom može nastati puno različitih
    kružnih i linearnih molekula DNA
  • može se dogoditi da dobijemo transformante s praznim vektorima tj. vektore bez inserta
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

što je knjižnica gena

A

skup klonova (najčešće bakterije E.coli ili kvasca S.cerevisiae) koji sadrže vektore (najčešće plazmide ili umjetne kromosme) u kojma su klonirani (ugrađeni, insertirani) svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma (npr. čovjeka) – u jednom klonu u pravilu se nalazi jedan fragment genoma

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

što je cDNA banka

A

sadrži kodirajuću DNA (ORFove) nekog organizma

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

što je genomska banka

A

sadrži kodirajuću i nekodirajuću DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

nabroji ostale enzime koji se koriste u gi

A

Ribonukleaze (RNaze) - RNaza A, RNaza H
DNaze - S1, Bal 31, DNaza I, egzonukleaza III
DNA-polimeraze - DNA-polimeraza I, Klenow fragment, Taq, reverzna transkriptaza
Polinukleotid fosfataza
Polinukleotid kinaza
Terminalna deoksinukleotidil transferaza
RNA-polimeraze

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

objasni RNazu A

A

endoribonukleaza - cijepa unutar lanca (izolirana iz goveđeg pankreasa)
aktivnost - cijepa fosfodiestersku vezu u jednolančanoj RNA ostavljajući 3’- fosfatnu grupu na pirimidinskim nukleotidima
primjena - uklanjanje RNA pri izolaciji plazmidne ili genomske DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

objasni RNazu H

A

izolirana iz bakterije E. coli
aktivnost - cijepa RNA do kratkih oligoribonukleotida i to samo ako se RNA nalazi u DNA/RNA-hibridu
- ne hidrolizira fosfodiesterske veze u ssDNA, dsDNA, ssRNA i dsRNA
primjena - priprema cDNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

objasni nukleazu S1

A

izolirana iz plijesni Aspergillus oryzae
aktivnost - hidrolizira i jednolančanu DNA i jednolančanu RNA do 5’-fosforil mono- ili
oligonukleitida, ali:
* ima 5x veću aktivnost na DNA nego na RNA
* ako se nalazi u velikom suvišku hidrolizira i dsDNA
* najslabiju aktivnost ima na DNA/RNA-hibridu
- aktivna je pri niskom pH (4,5) i u prisutnosti Zn2+
primjena - uklanjanje jednolančane DNA s krajeva dvolančanih fragmenata
- S1-mapiranje

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

što je S1 mapiranje

A

to je metoda koja se koristi za određivanje broja i duljine egzona nekom genu

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

kako se vrši S1 mapiranje

A
  1. mRNA se pomiješa s denaturiraom ili jednolančanom DNA - mRNA se komplementano sparuje s odgovarajućim genom (DNA)
  2. otopina koja sadrži RNA/DNA hibrid tretira se nukleazom S1
  3. u smjesi zaostaje samo DNA/RNA-hibrid - elektroforeza (broj i veličina fragmenata); fragmenti su zapravo egzon
  4. kloniranje egzona
  5. prevođenje RNA/DNA hibrida u dsDNA - tretiranje RNazom H i sinteza komplementarnog lanca DNA
  6. insercija dsDNA u vektor
  7. transformacija E.coli
  8. izolacija plazmida
  9. sekvencioniranje inserta
17
Q

objasni nukleazu BAL 31

A

aktivnost - hidrolizira DNA do 5’-fosforil-mononukleotida
- egzonukleazna aktivnost prema dsDNA (hidrolizira 5’- i 3’-kraj, skraćuje dsDNA)
- ostavlja ravne krajeve
primjena - skraćivanje dsDNA sa njenih krajeva, npr. detekcija promotora

18
Q

objasni DNazu 1

A

izolirana iz goveđeg pankreasa
aktivnost - endonukleaza koja hidrolizira jednolančanu i dvolančanu DNA ostavljajući fosfatnu skupinu na 5’-kraju
- aktivnost joj ovisi o prisutnosti Ca2+, a može se modulirati prisustvom Mg2+ (MgCl2) i Mn2+ (MnCl2)
* Mg2+ - nasumice uvodi jednolančane lomove
* Mn2+ - nasumično uvodi dvolančane lomove (djeluje kao nespecifični restrikcijski enzim)

19
Q

koja je primjena DNaze 1

A

u prisustvu Mn2+ - fragmentiranje dsDNA (priprema knjižnice gena)
u prisustvu Mg2+ - uvođenje jednolančanih lomova (supstrat za DNA-polimerazu I) - obilježavanje DNA (radioaktivno ili neradioaktivno)
- u velikim koncentracijama potpuno hidrolizira DNA - primjena pri izolaciji RNA; uklanjanje kalupa nakon in vitro transkripcije
- istraživanje interakcije DNA i proteina (“DNaze I footprinting”) - mogu se detektirati sekvencije DNA na koje se veže određeni protein jer DNaza ne može razgraditi DNA na koju je protein vezan; DNaza I doda se u otopinu DNA i odgovarajućeg proteina

20
Q

kako rade DNaza I i DNA-pol I

A

imamo jednolanč. lom koji prepoznaje DNA-pol I, ona svojom 5’-3’ pol. aktivnošću sintetizira nove nukleotide; dolazi do pomaka loma gdje se lom zapravo premjestio na drugi kraj

21
Q

objasni egzonukleazu III

A

izolirana iz bakterije E. coli
enzimska aktivnost: 3’-5’-egzonukleaza na dsDNA
aktivna je na: - jednolančanim lomovima
- ravnim krajevima
- isturenim jednolančanim krajevima, ali:
* nije aktivna na 3’-isturenim krajevima duljim od 3 nukleotida ni ss DNA

22
Q

koja je primjena egzonukleaze III

A

skraćivanje linearnih fragmenata dsDNA na samo jednom kraju - restrikcija, egzonukleaza III, nukleaza S1
priprema (dobivanje) jednolančane kružne DNA - Nb.Bpu10I (Fermentas) i egzonukleaza III

23
Q

objasni DNA-pol I

A

izolirana iz bakterije E. coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza - za sintezu potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTP-ovi i Mg2+

24
Q

koje sve aktivnosti ima DNA-pol I

A
  • 5’-3’-polimerazna aktivnost
  • 3’-5’-nukleazna aktivnost (“proofreading”, lektorirajuća aktivnost) - stimulirana zadnjim nesparenim nukleotidom na 3’-kraju
  • 5’-3’-nukleazna aktivnost (na jednolančanim lomovima) - produljuje 3’-kraj i degradira 5’-kraj (“nick-translation”)
  • ribonukleazna aktivnost (slično kao RNaza H)
25
Q

objasni Klenow fragment

A

C-terminalni dio (~70%) ima 5’-3’-polimeraznu i 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost – Klenow fragment (Klenow-polimeraza; Klenow enzim)
- 5’-3’-nukleazna aktivnost je nepoželjna u mnogim metodama GI
- 3’-5’-nukleazna lektorirajuća aktivnost je poželjna jer povećava vjernost sinteze DNA
- nema 5’-3’-nukleaznu aktivnost

26
Q

koja je primjena DNA pol I i Klenowog fragmenta

A
  • mogu koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
  • primjena – označavanje DNA
27
Q

objasni Taq polimerazu

A

izolirana iz Thermus aquaticus; rekombinantna iz E.coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza (za sintezu su potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTP-ovi i Mg2+)
aktivnosti - ima 5’-3’ polimeraznu aktivnost
- nema 3’-5’ egzonukleaznu aktivnost
- ima jako slabu 5’-3’-egzonuklezanu
- ostavlja 3’-istureni dA na 3’-kraju
termostabilna - vrijeme “poluživota” na 95°C je više od 40 minuta
može koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
primjena - “Polymerase Chain Reaction” (PCR) – lančana reakcija polimerazom
- AT-kloniranje - koristi se linearni vektor koji ima istureni T na 3’-kraju

28
Q

objasni reverznu transkriptazu

A

RNA-ovisna DNA-polimeraza - polimerizira DNA na kalupu RNA
izolirana iz retrovirusa; modificirana i klonirana u E.coli
upotreba – konstrukcija cDNA biblioteka
- izoliranu RNA propustiti kroz kolonu koja sadrži oligo-dT (veže se samo mRNA jer
sadrži poliA) te mRNA eluirati s 0,1 M NaCl
- dodati oligo-dT i reverznu transkriptazu – DNA/RNA-hibrid
- dodati RNazu H, DNA-polimerazu I, dNTPove
- stvaranje ravnih krajeva, ligacija i ligacija s vektorom

29
Q

koje su upotrebe DNA-polimeraza i DNaza u GI

A
  1. sinteza DNA prema kalupu (obilježavanje DNA – kemijski modificirani i radioaktivni nukleotidi) (DNA-pol I, Klenow frag, Taq)
  2. pretvaranje 5’- i 3’-krajeva u ravne krajeve (nukleaza S1, DNA-pol I)
  3. PCR – termostabilne polimeraze
  4. cDNA – reverzna transkriptaza
30
Q

objasni polinukleotid fosfatazu

A

uklanja fosfatnu grupu s 5’-kraja ss i ds DNA i RNA

31
Q

objasni polinukleotid kinazu

A

katalizira prijenos gama fosfata s ATP na 5’-OH skupinu ss i ds RNA i DNA

32
Q

objasni terminalnu deoksinukleotidil transferazu

A

izolirana iz goveđeg timusa
aktivnost - polimerizira deoksinukleotide na slobodnu 3’-OH skupinu ss i dsDNA
upotreba - obilježavanje DNA na 3’-kraju
- izrada knjižnica gena (npr: fragmentiranje genoma s DNazom I, na fragmente se doda poli-dA, a na linearizirane plazmide poli-dT . . .)

33
Q

objsani RNA-polimeraze

A

Koriste se za in vitro sintezu RNA ili obilježene RNA - RNA polimeraze virusa SP6, T7, T3

geneticko inz (7 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions