uvod Flashcards
definicija gen. inž.
Skup metoda koje omogućavaju uvođenje preciznih (ciljanih, točno određenih) genetičkih promjena u živoj stanici/organizmu
što je genetička promjena (modifikacija)
Promjena redoslijeda nukleotida u DNA – „mutacija” – „ciljana mutacija”
što je rekombinantna DNA
DNA koja se sastoji od dva ili više različitih fragmenata DNA; nastaje kombiniranjem (prespajanjem) različitih molekula DNA koje mogu potjecati iz samo jednog, ali i iz dva ili više različitih izvora/organizma
što je mutacija
Genetička promjena koja nastaje spontano ili djelovanjem mutagenog sredstva (“nasumična mutageneza”)
koja je primjena gen. inž.
Znanstvena istraživanja - najčešći primjer: inaktivacija i modifikacija pojedinih gena (konstrukcija novih alela), a time i određenih proteina (enzima)
Primjena istraživanja (npr. E.coli proizvodi inzulin . . . ): oplemenjivanje proizvodnih organizama (bakterije, kvasci, plijesni, kulture biljnih i životinjskih stanica, biljke, životinje); prehrambena industrija, farmaceutika, poljoprivreda, ekologija, obrada otpadnih voda . . . (npr proizvodnja enzima koji se primjenjuju u procesu proizvodnje hrane; proizvodnja lijekova . . . )
koji je osnovni princip GI
da se modifikacija/ciljanja mutacija uvodi u mol. DNA
dogma mol. genetike - DNA->replikacija->DNA->transkripcija->RNA->translacija->protein
modifikacija se uvodi u početnu mol. DNA
koje mogu biti modifikacije uvedene u DNA
- uklonjen jedan ili više gena
- dodan jedan ili više gena
- promijenjena razina ekspresije nekog gena
- modificiran jedan ili više gena (proteina)
kako možemo modificirati neki organizam
Oplemenjivanjem „klasičnim” metodama i metodama GI
kakvo je to klasično oplemenjivanje
imamo križanje, selekcija, križanje, selekcija,. . .; dugotrajno je i neprecizno
KLASIČNO OPLEMENJIVANJE NIJE GMO (to je više nasumična mutageneza)
ako nije moguće križanje druga opcija je nasumična mutageneza (sjeme se tretira mutagenim sredstvom, npr gama zrake, dolazi do dvolančanih lomova koji se popravljaju gen. rekombinacijom i nastaju mutanti)
kakvo je oplemenjivanje metodama GI
ono je preciznije, osniva se na racionalnom znanstvenom pristupu, potrebna su znanja i vještine iz molekularne genetike/biologije,
genetičkog inženjerstva – moguće je konstruirati biljku koja
se ne može dobiti klasičnim metodama, čak niti korištenjem nasumične mutageneze, dugotrajna i skupa komercijalizacija (stavljanje na tržište)
na koje ljudske sfere GMO i GI imaju utjecaj
temeljne znanosti – sva područja bio-znanosti (osobiti molekularnih bio-znanosti)
primijenjene znanosti – medicina, agronomija, proizvodnja hrane, veterina,
zaštita okoliša . . .
društvene i humanističke znanosti – pravo, politika, ekonomija, etika, bioetika . . .
koji organizmi nisu GMO
Prema Zakonu o GMO, organizmi oplemenjeni nasumičnom mutagenezom pomoću mutagenih agenasa nisu GMO! (njihovo objašnjenje je da bi ti mutirani organizmi mogli i sami nastati, bez mutagena, samo što ih to mutageno sredstvo ubrza)
koji su postupci i tehnike u GI
izolacija ili sinteza dijela (fragmenta) DNA od interesa —> in vitro modifikacija (promjena redosljeda nukleotida) DNA —-> unošenje modificirane DNA u živi organizam —> genetički modificirani organizam (GMO)
nabroji neke DNA od interesa
mRNA, tj. cDNA, fragmentirana genomska DNA, kemijski sintetizirana DNA, umnažanje dijela genoma (PCR)
kakva je to cDNA
coding DNA - kodirajuća DNA, do nje dolazimo izolacijom mRNA i reverznom transkripcijom do DNA
detaljnije opiši postupke i tehnike u GI
- DNA od interesa (najčešće sadrži neki gen)
- Ugradnja DNA (insert) u odgovarajući vektor (plazmid, rjeđe bakteriofag)
- transformacija/infekcija bakterije E. coli
- selekcija/odabir kolonije koja sadrži
željeni plazmid (vektor+insert) - uzgoj odabrane bakterije (kolonije, klona) s ciljem umnažanja i izolacije plazmida
- modifikacija, transformacija, analiza, modifikacija… klonirane DNA (puno metoda)
- transformacija organizma kojeg želimo modificirati (bakterija, kvasac, biljka, životinja…)
- GMO
- analiza
što je insert
DNA koja se ugrađuje
što je vektor
DNA u koju se ugrađuje insert; najčešće plazmid, rjeđe bakteriofag; plazmid se prvo linearizira i onda se ugrađuje insert
što je restrikcijsko mjesto
mjesto cijepanja, na tom mjestu se plazmid linearizira
što je ligacijska otopina
vektor + insert + ligaza; zapravo svaka otopina u kojoj se nalazi ligaza
ligacijsku otopinu čine i plazmidi s insertom i plazmidi bez inserta
zašto su neke kolonije plave boje
jer one sadrže plazmid bez inserta, imaju aktivan gen lacZ koji proizvodi beta- galaktozidazu koja hidrolizira x-gal i dolazi do obojenja
zašto su neke kolonije uobičajene boje (bijele?)
jer one sadrže plazmid s insertom, gen lacZ je inaktivan, nema beta-galaktozidaze i ne dolazi do hidrolize x-gal
kako se sve može eksprimirati klonirana i modificirana DNA
organizmu koji je različit od onog iz kojeg je DNA izolirana:
* transgen; transgeni organizam
* heterologna ekspresija
organizmu iz kojeg ta DNA potječe:
* cisgen; cisgeni organizam
* homologna ekspresija
navedi primjere primjene GI
Proizvodnja humanih proteina u bakteriji E.coli (heterologna ekspresija):
Neki problemi pri ekspresiji humanih gena u E.coli
* introni, sekvencije slične terminatorima, pristrana uporaba sinonimnih kodona
(“codon bias”)
* posttranslacijske modifikacije (proteoliza, glikozilacija, disulfidne veze), pravilna
trodimenzionalna struktura proteina, degradacija proteina
