uvod Flashcards
definicija gen. inž.
Skup metoda koje omogućavaju uvođenje preciznih (ciljanih, točno određenih) genetičkih promjena u živoj stanici/organizmu
što je genetička promjena (modifikacija)
Promjena redoslijeda nukleotida u DNA – „mutacija” – „ciljana mutacija”
što je rekombinantna DNA
DNA koja se sastoji od dva ili više različitih fragmenata DNA; nastaje kombiniranjem (prespajanjem) različitih molekula DNA koje mogu potjecati iz samo jednog, ali i iz dva ili više različitih izvora/organizma
što je mutacija
Genetička promjena koja nastaje spontano ili djelovanjem mutagenog sredstva (“nasumična mutageneza”)
koja je primjena gen. inž.
Znanstvena istraživanja - najčešći primjer: inaktivacija i modifikacija pojedinih gena (konstrukcija novih alela), a time i određenih proteina (enzima)
Primjena istraživanja (npr. E.coli proizvodi inzulin . . . ): oplemenjivanje proizvodnih organizama (bakterije, kvasci, plijesni, kulture biljnih i životinjskih stanica, biljke, životinje); prehrambena industrija, farmaceutika, poljoprivreda, ekologija, obrada otpadnih voda . . . (npr proizvodnja enzima koji se primjenjuju u procesu proizvodnje hrane; proizvodnja lijekova . . . )
koji je osnovni princip GI
da se modifikacija/ciljanja mutacija uvodi u mol. DNA
dogma mol. genetike - DNA->replikacija->DNA->transkripcija->RNA->translacija->protein
modifikacija se uvodi u početnu mol. DNA
koje mogu biti modifikacije uvedene u DNA
- uklonjen jedan ili više gena
- dodan jedan ili više gena
- promijenjena razina ekspresije nekog gena
- modificiran jedan ili više gena (proteina)
kako možemo modificirati neki organizam
Oplemenjivanjem „klasičnim” metodama i metodama GI
kakvo je to klasično oplemenjivanje
imamo križanje, selekcija, križanje, selekcija,. . .; dugotrajno je i neprecizno
KLASIČNO OPLEMENJIVANJE NIJE GMO (to je više nasumična mutageneza)
ako nije moguće križanje druga opcija je nasumična mutageneza (sjeme se tretira mutagenim sredstvom, npr gama zrake, dolazi do dvolančanih lomova koji se popravljaju gen. rekombinacijom i nastaju mutanti)
kakvo je oplemenjivanje metodama GI
ono je preciznije, osniva se na racionalnom znanstvenom pristupu, potrebna su znanja i vještine iz molekularne genetike/biologije,
genetičkog inženjerstva – moguće je konstruirati biljku koja
se ne može dobiti klasičnim metodama, čak niti korištenjem nasumične mutageneze, dugotrajna i skupa komercijalizacija (stavljanje na tržište)
na koje ljudske sfere GMO i GI imaju utjecaj
temeljne znanosti – sva područja bio-znanosti (osobiti molekularnih bio-znanosti)
primijenjene znanosti – medicina, agronomija, proizvodnja hrane, veterina,
zaštita okoliša . . .
društvene i humanističke znanosti – pravo, politika, ekonomija, etika, bioetika . . .
koji organizmi nisu GMO
Prema Zakonu o GMO, organizmi oplemenjeni nasumičnom mutagenezom pomoću mutagenih agenasa nisu GMO! (njihovo objašnjenje je da bi ti mutirani organizmi mogli i sami nastati, bez mutagena, samo što ih to mutageno sredstvo ubrza)
koji su postupci i tehnike u GI
izolacija ili sinteza dijela (fragmenta) DNA od interesa —> in vitro modifikacija (promjena redosljeda nukleotida) DNA —-> unošenje modificirane DNA u živi organizam —> genetički modificirani organizam (GMO)
nabroji neke DNA od interesa
mRNA, tj. cDNA, fragmentirana genomska DNA, kemijski sintetizirana DNA, umnažanje dijela genoma (PCR)
kakva je to cDNA
coding DNA - kodirajuća DNA, do nje dolazimo izolacijom mRNA i reverznom transkripcijom do DNA
detaljnije opiši postupke i tehnike u GI
- DNA od interesa (najčešće sadrži neki gen)
- Ugradnja DNA (insert) u odgovarajući vektor (plazmid, rjeđe bakteriofag)
- transformacija/infekcija bakterije E. coli
- selekcija/odabir kolonije koja sadrži
željeni plazmid (vektor+insert) - uzgoj odabrane bakterije (kolonije, klona) s ciljem umnažanja i izolacije plazmida
- modifikacija, transformacija, analiza, modifikacija… klonirane DNA (puno metoda)
- transformacija organizma kojeg želimo modificirati (bakterija, kvasac, biljka, životinja…)
- GMO
- analiza
što je insert
DNA koja se ugrađuje
što je vektor
DNA u koju se ugrađuje insert; najčešće plazmid, rjeđe bakteriofag; plazmid se prvo linearizira i onda se ugrađuje insert
što je restrikcijsko mjesto
mjesto cijepanja, na tom mjestu se plazmid linearizira
što je ligacijska otopina
vektor + insert + ligaza; zapravo svaka otopina u kojoj se nalazi ligaza
ligacijsku otopinu čine i plazmidi s insertom i plazmidi bez inserta
zašto su neke kolonije plave boje
jer one sadrže plazmid bez inserta, imaju aktivan gen lacZ koji proizvodi beta- galaktozidazu koja hidrolizira x-gal i dolazi do obojenja
zašto su neke kolonije uobičajene boje (bijele?)
jer one sadrže plazmid s insertom, gen lacZ je inaktivan, nema beta-galaktozidaze i ne dolazi do hidrolize x-gal
kako se sve može eksprimirati klonirana i modificirana DNA
organizmu koji je različit od onog iz kojeg je DNA izolirana:
* transgen; transgeni organizam
* heterologna ekspresija
organizmu iz kojeg ta DNA potječe:
* cisgen; cisgeni organizam
* homologna ekspresija
navedi primjere primjene GI
Proizvodnja humanih proteina u bakteriji E.coli (heterologna ekspresija):
Neki problemi pri ekspresiji humanih gena u E.coli
* introni, sekvencije slične terminatorima, pristrana uporaba sinonimnih kodona
(“codon bias”)
* posttranslacijske modifikacije (proteoliza, glikozilacija, disulfidne veze), pravilna
trodimenzionalna struktura proteina, degradacija proteina
koji su primjeri uspješne proizvodnje humanih proteina u bakteriji E.coli
somatostatin (1977)
inzulin (1978)
somatotropin (1979)
somatostatin?
peptid dugačak 14 ak
kemijski sintetizirana DNA koja kodira za somatostatin, fuzionirana s genom lacZ (kodiraza β-galaktozidazu) “in frame” (u okviru čitanja) i pod regulacijom promotora lac
translacijom nastaje fuzijski protein, cijanogen bromid cijepa peptidni lanac između Met i Ala te nastaje somatostatin
inzulin?
dva kratka polipeptidna lanaca
A-lanac: 21 aminokiselina
B-lanac: 30 aminokiselina
slična strategija kao i za somatostatin
dva plazmida (jedan sadrži sekvenciju za A-, a
drugi B-lanac)
zasebna ekspresija i izolacija A- i B-lanca
odvajanje β-galaktozidaze (BrCN)
izolacija i pročišćavanje
disulfidni mostovi između A- i B-lanaca
somatotropin?
191 aminokiselina
cDNA (kodirajuća DNA) sintetizirana pomoću reverzne transkriptaze na
temelju mRNA izolirane iz hipofize
ekspresija fuzijskog proteina
humani faktor VIII
Važnost:
neophodan za grušanje krvi
nemogućnost sinteze – hemofilija
Proizvodnja prije razvoja genetičkog inženjerstva:
izolacija i iz donirane krvi (skupo, komplicirano, virusi)
Problemi pri dobivanju iz E.coli:
gen: 186 kb, 25 introna
mRNA kodira za polipeptid od 2351 ak koji se posttranslacijski modificira
dva glikozilirana polipeptidna lanca koji sadrže 17 disulfidnih veza
koje su strategije za rješavanje problema vezanih uz humani faktor VIII
cjelokupna cDNA klonirana u stanicama hrčka u kulturi – jako slabi prinos
cDNA jednog i drugog polipeptida zasebno eksprimirana u stanicama hrčka
Ag promotor (kokošji β-aktin i zečji β-globin); signal za poliadenilaciju iz virusa SV40
Prinos povećan za više od 10 puta cjelokupna cDNA stavljena pod regulaciju promotora za „protein sirutke” (“whey acidic
protein”) i to u mliječnoj žlijezdi svinje
što je pharming
Korištenje transgenih biljaka i životinja za ekspresiju nekog transgena u svrhu izolacije
željenog proizvoda (farmacija, medicina, veterina…)
što je transgen
gen iz nekog drugog organizma (npr. ljudski gen u bakteriji ili bakterijski gen
u biljci itd)
što je transgeni organizam (GMO)
organizam koji u SVIM stanicama sadrži transgen
što je cisgeni organizam
organizam koji sadrži vlastiti gen modificiran metodama genetičkog inženjerstva
zašto se radi kloniranje transgenih organizama
jer je dobivanje transgenih organizama skupo pa je bolje klonirati dobivene
nabroji neka otkrića koja su utjecala na razvoja GI
1970 – izolacija i upotreba restrikcijskih endonukleaza
1972 – „in vitro rekombinacija” fragmenata DNA (restrikcijski enzimi i DNA-ligaze)
- DNA-ligaze omogućuju povezivanje fragmenata DNA
1973 – elektroforeza DNA u agaroznom gelu
- omogućava razdvajanje i vizualizaciju fragmenata DNA i izolaciju točno određenog
…ima još puno više na prezi
