domaćini i vektori u GI

Question 1

što su vektori

Answer 1

DNA molekule u koje se jednostavno može integrirati (insertirati, ugraditi) fragment DNA koji želimo klonirati (insert) u svrhu umnažanja u odgovarajućem domaćinu
- ideja je da se konstrukt REPLICIRA u domaćinu, najčešće su to plazmidi

Question 2

što je domaćin

Answer 2

organizam (najčešće bakterija E. coli) koji se koristi za umnažanje, repliciranje vektora odnosno vektora s insertom

Question 3

koji je najčešći domaćin

Answer 3

bakterija Escherichia coli - univerzalni domaćin za kloniranje, kada je to potrebno, koriste se i neki drugi mikroorganizmi (kad je npr. to što želimo replicirati toksično za e. coli)

Question 4

kakav se tip e. coli koristi

Answer 4

ne koristi se divlji tip nego odgovarajući sojevi (mutanti, GMM)
- imaju mutacije/modifikacije koje ih čine dobrim domaćinima
- različiti sojevi i mutacije za različite namjene

Question 5

kako se označavaju geni koji su mutirani

Answer 5

označavaju se s tri mala slova kojima se može dodati jedno veliko slovo i to u kurzivu ili podcrtano: recA (u kurzivu) ili recA (podcrtano) - taj recA znai da je e. coli mutant za taj gen tj. da je taj gen nefunkcionalan, ne kodira za protein

Question 6

što znače “+” ili “-” iza oznake gena

Answer 6

koriste se da se naglasi da li je navedeni gen divljeg tipa ili je mutiran (je li funkcionalan ili nije): recA+ ili recA-
mogu se navoditi i uz oznaku fenotipa: Lac+ (može koristiti laktozu za izvor ugljika) ili Lac- –> oznaka fenotipa je je veliko početno slovo i isto se sastoji od 3 slova i nije u kurzivu

Question 7

kako se može označavati specifični alel

Answer 7

specifični alel nekog gena označava se brojem: leuB6 (leuB je mutiran, a oznaka alela je 6)

Question 8

kako se navodi prisutnost ili odsutnost F-faktora

Answer 8

prisutnost ili odsutnost F-faktora navodi se na početku opisa genotipa:
* F’ (sadrži f faktor ali taj je plazmid bio dio genoma bakterije ali se izdvojio i povukao dio njezinog genoma i cirkularizirao se), F- (ne sadrži f faktor), F+ (sadrži f faktor), Hfr (f faktor integriran u genom bakterije)

Question 9

kako se označava prisutnost profaga i plazmida

Answer 9

prisutnost profaga i plazmida označava se zagradama: F’[proAB+] –> stanica ima f faktor i operon proAB na plazmidu (on služi za sintezu prolina)

Question 10

što znači oznaka Δ

Answer 10

oznaka Δ označava deleciju: Δ(lac-proAB)

Question 11

kako se označava rezistencija

Answer 11

rezistencija – oznaka fenotipa: StrR, AmpR , BleR , TetR , NalR , EryR . . . (a ako je osjetljiva na neki antibiotik piše se S u indeks)

Question 12

što znači dvotočka

Answer 12

inaktivacija gena insercijom: leuB::Tn10(TetR) –> u orf leuB se ugradio Tn10, nema proteina leuB, ali je bakterija rezistentna na tetraciklin
fenotip ovakve bakterije bi bio LeuB-, TetR

Question 13

nabroji neke uobičajene mutacije sojeva bakterije e. coli

Answer 13

dam – inaktivirana metilacija GATC sekvencije
dcm – inaktivirana metilacija CCWGG sekvencije
hsdR – restrikcija u hsd RM-sustavu (r-m+) – (restrikcijski enzimi 1. skupine)
hsdS – restrikcija i modifikacija u hsd RM sustavu
lacZ – kodira za za β–galaktozidazu (lacZ mutiran, ne nastaje β–galaktozidaza)
Δ(lac-proAB) – delecija fragmenta od lac operona do operona proAB
recA – homologna rekombinacija, SOS-odgovor
recF i recJ – homololgna rekombinacija među plazmidima
ung – kodira za uracil-N-glikozidazu (cijepa glikozidnu vezu između šećera i uracila)
dut – kodira za dUTPazu

Question 14

kako se konstruiraju sojevi e. coli

Answer 14

Sojevi se konstruiraju metodama genetičkog inženjerstva i mutagenezom
DNA konstruirana in vitro se u bakteriju E. coli unosi transformacijom, konjugacijom ili transdukcijom

Question 15

što su shuttle-vektori

Answer 15

vektori koji se mogu koristiti (umnažati, replicirati) u dva ili više različitih organizama (npr. E. coli i S. cerevisiae)

Question 16

nabroji osnovna svojstva dobrog vektora

Answer 16

1. samostalna replikacija u bakteriji E. coli
2. mala molekulska masa (nekoliko kb)
3. veliki broj kopija po stanici (nekoliko stotina, jer je potrebno malo stanica ako imaju puno plazmida)
4. jednostavna izolacija iz bakterije E. coli
5. više jedinstvenih mjesta za restrikcijske enzime - poželjno je da plazmid ima restrikcijska mjesta koja se samo jedanput pojavljuju
6. polilinker, višestruko mjesto za kloniranje, mjesto gdje ubacujemo insert “multiple cloning site”, MCS
7. jednostavna selekcija stanica koje sadrže vektor (najčešće rezistencija na neki antibiotik)
8. jednostavna selekcija vektora koji sadrže insert

Question 17

kako dijelimo vektore obzirom na podrijetlo

Answer 17

Obzirom na podrijetlo vektori se dijele na:
1. plazmidne vektore
2. virusne vektore
3. kombinaciju plazmidnih i virusnih vektora (plazmidno-virusni vektori)
4. umjetne kromosome (YAC, BAC)

Question 18

što je banka, knjižnica gena

Answer 18

skup klonova koji sadrže vektore u kojima su klonirani svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma

Question 19

objasni pSC101

Answer 19

prvi plazmid koji je korišten kao vektor (1973.)
prirodni plazmid u bakteriji Salmonalla panama
samo do 5 molekula po stanici E. coli
gen za rezistenciju na antibiotik tetraciklin i ishodište replikacije
više od 9 kb

Question 20

objasni pBR322

Answer 20

konstruiran 1977.
manje od 4,5 kb; rezistencija na dva antibiotika
oko 20 plazmida po stanici E.coli

Question 21

koji su genetički biljezi/markeri za selekciju (odabir/probir) transformanata E. coli

Answer 21

najbolje je gledati je li e. coli rezistentan ili osjetljiva na neki antibiotik

Question 22

koje regije ima pBR322

Answer 22

bla - rezistencija na ampicilin (ApR) (ona kodira i za ß-laktamazu)
tet - rezistencija na tetraciklin (TcR)
rep - replikacija plazmida (u toj je regiji ishodište replikacije plazmida)
rop - regulacija broja kopija plazmida

Question 23

kako se može vršiti kloniranje pBR322

Answer 23

Kloniranje (1) fragment se insertira u tet, transformanti se selekcioniraju na podlozi s ampicilinom i repliciraju na podlogu s tetraciklinom
Kloniranje (2) fragment se insertira u bla, transformanti se selekcioniraju na podlozi s tetraciklinom i repliciraju na podlogu s ampicilinom

Question 24

kako se regulira broj molekula plazmida u stanici

Answer 24

plazmidi imaju ishodište replikacije koje potječe iz plazmida ColE1
1. u regiji rep nastaje RNA II i RNA I
2. dalje se na plazmidu nalazi gen rop koji kodira za protein rop
3. RNA II je komplementarna s DNA i nastaje DNA/RNA-hibrid
4. DNA/RNA-hibrid prepoznaje RNaza H koja cijepa RNA i nastaje klica za replikaciju plazmida
5. ako se spare RNA II i RNA I (a mogu se jer su komplementarne) nastaje dvolančana RNA koju RNaza ne može cijepati i nema klice i ne dolazi do replikacije DNA, njihovo vezanje potpomaže protein kodiran genom rop
–> uklanjanje (delecija) gena rop rezultira većim brojem plazmida u stanici

Question 25

objasni suvremene plazmide

Answer 25

mutacije u genu za RNA I ili RNA II - 500 do 700 molekula po stanici pri 37°C; ~20 molekula po stanici pri 30°C
male dimenzije – često manje od 3 kb
imaju polilinkere
lacZ – kodira za β-galaktozidazu (točnije N-terminalni dio ß-galaktozidaze), omogućava jednostavan odabir kolonija koje
sadrže plazmid s insertom
- osniva se na intraalelnoj (intragenskoj) komplementaciji
- α-komplementacija
- selekcija/sustav plavo-bijelo

Question 26

što su polilinkeri

Answer 26

MCS, multiple cloniong site - kratka “umjetna” sekvencija (50ak pb) koja sadrži jedinstvena restrikcijska mjesta za 10 do 20 pa čak i više restrikcijskih enzima

Question 27

objasni pUC18 i pUC19

Answer 27

imaju deletiran rop, mutiran rep (kodira za RNA I i RNA II) –> zato ima veliki broj kopija u stanici
lacZ kodira za N-terminalni dio enzima β-galaktozidaze (prvih 59 aminokiselina, taj dio se zove α-peptid)
imaju MCS (polilinker) u ORF-u lacZ (ne utječe na funkciju α-peptida)
MCS (57 pb; 19 aminokiselina - ne dolazi do frame shifta, 57 je djeljivo s 3) - polilinkeri u oba plazmida su slični samo su rotirani za 180°
- u plazmidu pUC18 insertiran u 5. kodon gena (ORF-a) lacZ
- u plazmidu pUC19 insertiran u 6. kodon gena (ORF-a) lacZ
–> polilinkeri ne utječu na α-peptid jer su in-frame

Question 28

objasni α-komplementaciju

Answer 28

1. plazmidom kao što je pUC transformirati bakteriju E. coli genotipa:
   - Δ(lac-proAB)
   - F’[lacIq Δ(lacZ)M15 proA+proB+]
   - Δ(lacZ)M15 kodira za enzim kojem nedostaju aminokiseline na N-kraju (od 11. do 41.) – ω-peptid
2. stanice nacijepiti na podlogu s IPTG i X-gal
   - IPTG (izopropil-β-tiogalaktozid) - induktor operona lac (ekspresija alela lacZ na plazmidu i na epizomu)
   - X-gal (5-bromo-4-kloro-indoil-β-D-galaktozid) - supstrat za β-galaktozidazu (nastaje plavo obojenje)
3. komplementacija između 5’-kraja gena lacZ na plazmidu (kodira za α-peptid) i 3’-kraja gena na epizomu – Δ(lacZ)M15 koji kodira za ω-peptid
   - α-peptid i ω-peptid tvore aktivni kompleks koji cijepa X-gal te nastaju plave kolonije
4. insercija fragmenta u polilinker – inaktivacija gena lacZ – bijele kolonije
5. α-komplementacija – intragenomska komplementacija – „selekcija plavo-bijelo”

Question 29

koje su dodatne informacije vezane uz α-komplementaciju

Answer 29

aktivna β-galaktozidaza je tetramer
ω-peptid (nedostaju aminokiseline na N-kraju. 11. do 41.) ne može tvoriti tetramer pa ne nastaje aktivna β-galaktozidaza
u prisustvu α-peptida (prvih 59 aminokiselina β-galaktozidaze) i ω-peptida može nastati aktivni tetramer (aktivna β-galaktozidaza)
Stanica ima dva inaktivna alela gena lacZ ali stanica ima fenotip kao da ima funkcionalni alel lacZ – intraalelna komplementacija gena