domaćini i vektori u GI Flashcards
što su vektori
DNA molekule u koje se jednostavno može integrirati (insertirati, ugraditi) fragment DNA koji želimo klonirati (insert) u svrhu umnažanja u odgovarajućem domaćinu
- ideja je da se konstrukt REPLICIRA u domaćinu, najčešće su to plazmidi
što je domaćin
organizam (najčešće bakterija E. coli) koji se koristi za umnažanje, repliciranje vektora odnosno vektora s insertom
koji je najčešći domaćin
bakterija Escherichia coli - univerzalni domaćin za kloniranje, kada je to potrebno, koriste se i neki drugi mikroorganizmi (kad je npr. to što želimo replicirati toksično za e. coli)
kakav se tip e. coli koristi
ne koristi se divlji tip nego odgovarajući sojevi (mutanti, GMM)
- imaju mutacije/modifikacije koje ih čine dobrim domaćinima
- različiti sojevi i mutacije za različite namjene
kako se označavaju geni koji su mutirani
označavaju se s tri mala slova kojima se može dodati jedno veliko slovo i to u kurzivu ili podcrtano: recA (u kurzivu) ili recA (podcrtano) - taj recA znai da je e. coli mutant za taj gen tj. da je taj gen nefunkcionalan, ne kodira za protein
što znače “+” ili “-” iza oznake gena
koriste se da se naglasi da li je navedeni gen divljeg tipa ili je mutiran (je li funkcionalan ili nije): recA+ ili recA-
mogu se navoditi i uz oznaku fenotipa: Lac+ (može koristiti laktozu za izvor ugljika) ili Lac- –> oznaka fenotipa je je veliko početno slovo i isto se sastoji od 3 slova i nije u kurzivu
kako se može označavati specifični alel
specifični alel nekog gena označava se brojem: leuB6 (leuB je mutiran, a oznaka alela je 6)
kako se navodi prisutnost ili odsutnost F-faktora
prisutnost ili odsutnost F-faktora navodi se na početku opisa genotipa:
* F’ (sadrži f faktor ali taj je plazmid bio dio genoma bakterije ali se izdvojio i povukao dio njezinog genoma i cirkularizirao se), F- (ne sadrži f faktor), F+ (sadrži f faktor), Hfr (f faktor integriran u genom bakterije)
kako se označava prisutnost profaga i plazmida
prisutnost profaga i plazmida označava se zagradama: F’[proAB+] –> stanica ima f faktor i operon proAB na plazmidu (on služi za sintezu prolina)
što znači oznaka Δ
oznaka Δ označava deleciju: Δ(lac-proAB)
kako se označava rezistencija
rezistencija – oznaka fenotipa: StrR, AmpR , BleR , TetR , NalR , EryR . . . (a ako je osjetljiva na neki antibiotik piše se S u indeks)
što znači dvotočka
inaktivacija gena insercijom: leuB::Tn10(TetR) –> u orf leuB se ugradio Tn10, nema proteina leuB, ali je bakterija rezistentna na tetraciklin
fenotip ovakve bakterije bi bio LeuB-, TetR
nabroji neke uobičajene mutacije sojeva bakterije e. coli
dam – inaktivirana metilacija GATC sekvencije
dcm – inaktivirana metilacija CCWGG sekvencije
hsdR – restrikcija u hsd RM-sustavu (r-m+) – (restrikcijski enzimi 1. skupine)
hsdS – restrikcija i modifikacija u hsd RM sustavu
lacZ – kodira za za β–galaktozidazu (lacZ mutiran, ne nastaje β–galaktozidaza)
Δ(lac-proAB) – delecija fragmenta od lac operona do operona proAB
recA – homologna rekombinacija, SOS-odgovor
recF i recJ – homololgna rekombinacija među plazmidima
ung – kodira za uracil-N-glikozidazu (cijepa glikozidnu vezu između šećera i uracila)
dut – kodira za dUTPazu
kako se konstruiraju sojevi e. coli
Sojevi se konstruiraju metodama genetičkog inženjerstva i mutagenezom
DNA konstruirana in vitro se u bakteriju E. coli unosi transformacijom, konjugacijom ili transdukcijom
što su shuttle-vektori
vektori koji se mogu koristiti (umnažati, replicirati) u dva ili više različitih organizama (npr. E. coli i S. cerevisiae)
nabroji osnovna svojstva dobrog vektora
- samostalna replikacija u bakteriji E. coli
- mala molekulska masa (nekoliko kb)
- veliki broj kopija po stanici (nekoliko stotina, jer je potrebno malo stanica ako imaju puno plazmida)
- jednostavna izolacija iz bakterije E. coli
- više jedinstvenih mjesta za restrikcijske enzime - poželjno je da plazmid ima restrikcijska mjesta koja se samo jedanput pojavljuju
- polilinker, višestruko mjesto za kloniranje, mjesto gdje ubacujemo insert “multiple cloning site”, MCS
- jednostavna selekcija stanica koje sadrže vektor (najčešće rezistencija na neki antibiotik)
- jednostavna selekcija vektora koji sadrže insert
kako dijelimo vektore obzirom na podrijetlo
Obzirom na podrijetlo vektori se dijele na:
1. plazmidne vektore
2. virusne vektore
3. kombinaciju plazmidnih i virusnih vektora (plazmidno-virusni vektori)
4. umjetne kromosome (YAC, BAC)
što je banka, knjižnica gena
skup klonova koji sadrže vektore u kojima su klonirani svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma
objasni pSC101
prvi plazmid koji je korišten kao vektor (1973.)
prirodni plazmid u bakteriji Salmonalla panama
samo do 5 molekula po stanici E. coli
gen za rezistenciju na antibiotik tetraciklin i ishodište replikacije
više od 9 kb
objasni pBR322
konstruiran 1977.
manje od 4,5 kb; rezistencija na dva antibiotika
oko 20 plazmida po stanici E.coli
koji su genetički biljezi/markeri za selekciju (odabir/probir) transformanata E. coli
najbolje je gledati je li e. coli rezistentan ili osjetljiva na neki antibiotik
koje regije ima pBR322
bla - rezistencija na ampicilin (ApR) (ona kodira i za ß-laktamazu)
tet - rezistencija na tetraciklin (TcR)
rep - replikacija plazmida (u toj je regiji ishodište replikacije plazmida)
rop - regulacija broja kopija plazmida
kako se može vršiti kloniranje pBR322
Kloniranje (1) fragment se insertira u tet, transformanti se selekcioniraju na podlozi s ampicilinom i repliciraju na podlogu s tetraciklinom
Kloniranje (2) fragment se insertira u bla, transformanti se selekcioniraju na podlozi s tetraciklinom i repliciraju na podlogu s ampicilinom
kako se regulira broj molekula plazmida u stanici
plazmidi imaju ishodište replikacije koje potječe iz plazmida ColE1
1. u regiji rep nastaje RNA II i RNA I
2. dalje se na plazmidu nalazi gen rop koji kodira za protein rop
3. RNA II je komplementarna s DNA i nastaje DNA/RNA-hibrid
4. DNA/RNA-hibrid prepoznaje RNaza H koja cijepa RNA i nastaje klica za replikaciju plazmida
5. ako se spare RNA II i RNA I (a mogu se jer su komplementarne) nastaje dvolančana RNA koju RNaza ne može cijepati i nema klice i ne dolazi do replikacije DNA, njihovo vezanje potpomaže protein kodiran genom rop
–> uklanjanje (delecija) gena rop rezultira većim brojem plazmida u stanici
objasni suvremene plazmide
mutacije u genu za RNA I ili RNA II - 500 do 700 molekula po stanici pri 37°C; ~20 molekula po stanici pri 30°C
male dimenzije – često manje od 3 kb
imaju polilinkere
lacZ – kodira za β-galaktozidazu (točnije N-terminalni dio ß-galaktozidaze), omogućava jednostavan odabir kolonija koje
sadrže plazmid s insertom
- osniva se na intraalelnoj (intragenskoj) komplementaciji
- α-komplementacija
- selekcija/sustav plavo-bijelo
što su polilinkeri
MCS, multiple cloniong site - kratka “umjetna” sekvencija (50ak pb) koja sadrži jedinstvena restrikcijska mjesta za 10 do 20 pa čak i više restrikcijskih enzima
objasni pUC18 i pUC19
imaju deletiran rop, mutiran rep (kodira za RNA I i RNA II) –> zato ima veliki broj kopija u stanici
lacZ kodira za N-terminalni dio enzima β-galaktozidaze (prvih 59 aminokiselina, taj dio se zove α-peptid)
imaju MCS (polilinker) u ORF-u lacZ (ne utječe na funkciju α-peptida)
MCS (57 pb; 19 aminokiselina - ne dolazi do frame shifta, 57 je djeljivo s 3) - polilinkeri u oba plazmida su slični samo su rotirani za 180°
- u plazmidu pUC18 insertiran u 5. kodon gena (ORF-a) lacZ
- u plazmidu pUC19 insertiran u 6. kodon gena (ORF-a) lacZ
–> polilinkeri ne utječu na α-peptid jer su in-frame
objasni α-komplementaciju
- plazmidom kao što je pUC transformirati bakteriju E. coli genotipa:
- Δ(lac-proAB)
- F’[lacIq Δ(lacZ)M15 proA+proB+]
- Δ(lacZ)M15 kodira za enzim kojem nedostaju aminokiseline na N-kraju (od 11. do 41.) – ω-peptid - stanice nacijepiti na podlogu s IPTG i X-gal
- IPTG (izopropil-β-tiogalaktozid) - induktor operona lac (ekspresija alela lacZ na plazmidu i na epizomu)
- X-gal (5-bromo-4-kloro-indoil-β-D-galaktozid) - supstrat za β-galaktozidazu (nastaje plavo obojenje) - komplementacija između 5’-kraja gena lacZ na plazmidu (kodira za α-peptid) i 3’-kraja gena na epizomu – Δ(lacZ)M15 koji kodira za ω-peptid
- α-peptid i ω-peptid tvore aktivni kompleks koji cijepa X-gal te nastaju plave kolonije - insercija fragmenta u polilinker – inaktivacija gena lacZ – bijele kolonije
- α-komplementacija – intragenomska komplementacija – „selekcija plavo-bijelo”
koje su dodatne informacije vezane uz α-komplementaciju
aktivna β-galaktozidaza je tetramer
ω-peptid (nedostaju aminokiseline na N-kraju. 11. do 41.) ne može tvoriti tetramer pa ne nastaje aktivna β-galaktozidaza
u prisustvu α-peptida (prvih 59 aminokiselina β-galaktozidaze) i ω-peptida može nastati aktivni tetramer (aktivna β-galaktozidaza)
Stanica ima dva inaktivna alela gena lacZ ali stanica ima fenotip kao da ima funkcionalni alel lacZ – intraalelna komplementacija gena
