Vektoren und Klonierung Flashcards
Was bedeutet Klonierung?
Die Vervielfältigung von DNA
Was ist ein Klonierungsvektor?
Transportmittel für die Übertragung von Fremd-DNA in eine lebende Empfängerzelle
Welche Regionen muss ein Klonierungsvektor aufweisen?
Origin of Replication Selektionsmarker (oft Antibiotikaressistenz) Klonierungsstelle (Polylinker)
Der Replikationsursprung entscheidet über __________________, die in einem Bakterium vorliegen.
Der Replikationsursprung entscheidet über die Zahl der Plasmidkopien, die in einem Bakterium vorliegen
Die Klonierungsstelle enthält _________, die nur ________ im Vektor vorkommen.
Die Klonierungsstelle enthält Schnittstellen, die nur einmal im Vektor vorkommen
Was versteht man unter der Klonierungskapazität eines Vektors?
Die für den Vektor maximale Größe des Inserts
Was versteht man unter der Handhabbarkeit eines Vektors?
Stabilität des Vektors
Welche beiden Vektoren haben die geringste/höchste Klonierungskapazität?
geringste: Plasmid & 𝝀-Phage höchste: bacterial/yeast artificial chromosome (BAC/YAC)
Je höher die __________ eines Vektors, desto geringer ist seine __________.
Je höher die Klonierungskapazität eines Vektors ist, desto geringer ist seine Handhabbarkeit.
Was ist ein shuttle-Vektor?
Ein Vektor welcher in 2 verschiedenen Organismen funktional ist.
Wofür verwendet man shuttle-Vektoren?
DNA wird zunächst in Bakterien kloniert und die DNA dann in den Zielorganismus transferiert, wo das Genprodukt gebildet wird.
Welche Komponenten benötigt ein shuttle-Vektor neben denen eines normalen Vektors?
Einen weiteren Replikationsursprung und einen weiteren selektierbaren Marker
Welchen Organismus befällt der Phage 𝝀 ?
E. coli
Wie kann der Phage 𝝀 als Vektor verwendet werden?
In dem Genom des Phagen 𝝀 gibt es eine Region, welche nicht für essentielle Produkte kodiert. Diese Region kann durch Fremd-DNA ersetzt werden.
Was ist eine Bedingung für die Verwendung des 𝝀 Phagen als Vektor?
Die Gesamtgröße des Genoms des Phagen 𝝀’s darf nur um ± 10% von der natürlichen Größe abweichen.
Was ist ein Relacementverktor ?
Bei einem Replacementvektor wird zu nächst die Region mit den nicht essentiellen Genen durch ein “Stuffer-Fragment” ersetzt. Dieses kann anschließend durch ein Insert ersetzt werden.
Wie groß sind die Inserts der Replacementvektoren?
10-20 kB
Wofür wird ein Replacementvektor verwendet?
genomische DNA-Banken
Was ist ein Insertionsvektor?
Bei einem Insertionsvektor wird das Genom des 𝝀 Phagen an einer Stelle geschnitten und ein Insert dort eingefügt.
Wie Groß sind die Inserts bei Insertionsvektoren?
0-10 kB
Wofür werden Insertionsvektoren verwendet?
cDNA-Banken
Wie wird eine Genbank hergestellt?
- Gesamte Genom des Organismus durch Restriktionsenzyme in Fragmente zerlegen 2. Einbringen der Fragmente in 𝝀 Phagen 3. Einbringen der DNa-Fragmente in E. coli durch Infizierung mit 𝝀 Phagen
Wie durchsucht man eine Genbank nach einer Sequenz?
- “Fingerabdruck” von der Orginalplatte 2. Lyse der der Bakterien und Denaturierung der DNA auf der Membran des Fingerabdruckes 3. Hybridisierung mit markierter DNA-Sonde
Wie werden cDNA-Banken hergestellt?
- Synthese des cDNA-Stranges 2. Synthese des komplementären Doppelstranges 3. Klonierung in Phagen 4. Isolierung von Phagen
Wie erfolgt die Synthese eines cDNA-Stranges?
- Hybridisierung der mRNA mit oligo-dT Primer 2. Transkription der mRNA in cDNA 3. Entfernung der mRNA durch alkalische Lösung 4. Anfügen eines Poly-G-Schwanzes an das 3’-Endes der cDNA
Wie erfolgt die Synthese des zur cDNA-Komplementären Stranges?
- Hybridisierung mit Oligo-dC Primer 2. Synthese des komplementären Stranges 3. Schutz vor Eco R I durch Methylierung
Was sind Cosmide?
Plasmide, die eine 𝝀 cos-site enthalten
Während ______ öfter in einer Zelle vorkommen können, kommen ______ maximal einmal pro Zelle vor.
Während Plasmide öfter in einer Zelle vorkommen können, kommen BACs maximal einmal pro Zelle vor
Was ist eine genomische Bank/Genbank?
Sammlung von rekombinanten Klonen, die ein vollständiges Genom repräsentieren
Wozu verwendet man genomische Banken?
Zum finden und Klonieren eines Gens Zur Kartierung von Genomen und Genomabschnitten Zur Sequenzanalyse eines Genoms
Was sind die Anforderungen an eine genomische Bank?
Repräsentivität Technisch einfache Handbarkeit Stabilität der klonierten DNA
Welche Klonierungskapazität haben die einzelnen Vektoren?
- Plasmid → max. 8 kb
- lamda-Phage → max. 25 kb
- Cosmide → max. 44 kb
- P1-Phage → max. 100 kb
- BAC → max. 300 kb
- YAC → max. 1000 kb
