Reportergene Flashcards
Wie lauteten die Allgemeine Definition von Reporter- und Markergenen?
Genprodukte der Reporter-/Markergene erlauben den Nachweis und/oder die Selektion von Ereignissen oder Eigenschaften von biologischen Substanzen bzw. Organismen
Wodurch zeichnet sich ein Markergen aus?
Erlauben die Selektion von gesuchten Ereignissen
Wodurch zeichnet sich ein Reportergen aus?
- Nicht selektiv
- Genprodukte jedoch leicht nachzuweisen
Wofür können Reporter-/Markergene verwendet werden?
- Selektionsmarker
- Bestimmung der Enzymaktivität
- Expressionsmust und -stärke
- Lokalisation von Proteinen in Zellen und Geweben
Wie kann die 𝛃 -Galactosidase als Reportergen fungieren?
- Eigentlich katalysiert die 𝛃-Galactosidase die Spaltung von Lactose in Galactose und Glucose
- alternative kann X-Gal (farblos) in 5-Brom-4-Chlor-indigo (tiefblau) umgewandelt werden
- Durch Fusion mit einem Promotor kann so sichtbar gemacht werden in welchen Teilen eines Organismus das eigentliche Gen aktiv ist
In welchen Organsimen kann die 𝛃-Galactosidase nicht als Reportergen verwendet werden? Wieso? Was wird alternativ benutzt?
⇒ Pflanzen, da alle Pflanzen die 𝛃-Galactosidase bereits in ihrem Genom besitzen
Alternative: 𝛃-Glucuoronidase (=GUS)
Was unterscheidet GUS von der 𝛃-Glucosidase?
- X-Gluc als Substrat antelle von X-Gal
Was ist der Nachteil an GUS und 𝛃-Galactosidase als Reportergen?
Es ist keine lebendfärbung möglich
Was ist die Luciferase?
- Protein, welches Glühwürmchen zum leuchten bringt
Wie wirkt die Luciferase?
Katalysiert die Umwandlung von Luciferin in Oxyluciferin unter der Emmission von grün-gelbem Licht.
Wie kann die Luciferase als Reportergen wirken?
- Gen für die Luciferase wird mit dem Promotor des zu untersuchenden Gens fusioniert
- Ansprühen der Pflanze mit Luciferin → Emmission von Licht an Orten wo Luciferase exprimiert wird
Was sind Vor-/Nachteile von der Verwendung von Luciferase als Reportergen?
Vorteile:
- Gut quantifizierbar
- Untersuchungen im Lebenden Organismus
Nachteile:
- Leuchten nur schwer zu erfassen → teure Kammeras notwendig
Wofür steht “GFP”?
Green flourescent protein
Aus welchem Organsimus wurde GFP ursprünglich isoliert?
Aequorea victoria
Wie kann GFP als Reporterprotein dienen?
GFP wird mit dem zu untersuchendem Protein fusioniert → Überall dort wo das Protein exprimiert wird emmitiert GFP bei Anregung Licht
Was sind die Vorteile von GFP? Wodurch wird es in seiner Anwendung eingeschränkt?
Vorteile:
- Braucht keine Co-Faktoren
- ermöglicht Analysen im lebenden Organismus
Limitation:
Funktioniert nicht im sauren Millieu
Welche Möglichkeiten gibt es um Protein-Protein-Interaktion sichtbar zu machen?
- FRET
- BiFC
- Yeast two-hybrid-System
Wofür steht “FRET”?
Flurescent resonace energy transfer
Auf was für einem Grundprinzip beruhen untersuchungen mit FRET?
⇒ Energietransfer zwischen zwei Fluorochromen durch räumliuche Nähe der flureszierenden Proteine
→ Emmisionsspektrum des einen flureszierenden Proteins liegt im Anregungsspektrum des anderen
bsp.: Emmission von GFP regt YFP an
Wie kann man mit FRET untersuchen ob zwei Proteine miteinader interagieren?
- Fusion des einen Proteins mit GFP, das ander mit YFP
- Anregung des GFPs
- Falls YFP emmitiert → Beweis für räumliche Nähe der Proteine, jedoch kein direkter Beweis der Interaktion
Was sind die Nachteile von FRET?
- Kein direkter Beweis für die Interaktion
- nur sehr geringe unterschiede in den Emmisionspektren (Bsp. GFP: 509 nm / YFP: 512 nm)
Wofür steht BiFC?
Bimolecular fluorescence complementation
Wie geht man bei der BiFC vor? Was ist der Vorteil gegenüber FRET? Was ist ein Nachteil?
Vorgehen
- Fluoreszierendes Protein (z.B YFP) wird auf die beiden zu untersuchenden Proteine aufgeteilt
- Emission erfolgt wenn beide Domänen des fluoreszierenden Proteins bei der Protein-Protein-Interaktion wieder zusammengefügt werden
Vorteil gegenüber FRET:
⇒ direkter Nachweis der Protein-Protein-Interaktion
Nachteil:
- Rekonstruktion des fluoreszierenden Proteins ist irreversibel → Untersuchungen von der dynamischen Interaktion von Proteinen nicht möglich
Was ist Cameleon ?
- Ein FRET basierter Calcium indikator für Untersuchungen von Calcium als Botenstoff
Wie funktioniert Cameleon?
- Zwei fluoreszierenden Proteine sind über ein Calcium-bindendes linear (solange kein Calcium vorhanden ist) miteinander verbunden
- Wenn Calcium vorhanden ist kommt es zu einer Konformationsänderung des Calcium-bindenden Proteins → beiden fluoreszierende Proteine dicht beisamen → FRET
Was ist das Grundprinzip des Yeast-two-hybrid Systems?
Durch die Interaktion von Proteinen kommt es zur Expression eines Reportergens
Was sind die Schritte für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe des Yeast-two-hybrid Systems?
- Erstellung eines Fusionproteins mit der DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und einem anderem Protein (“bait”)
- Ein weiters Protein (“prey”) wird mit der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors fusioniert
- Interargieren Bait und Prey miteinander so kommt es zur Transkription des Reportergens
Was sind die Anwendungen des Yeast-two-hybrid Systems?
- Untersuchung zweier bekannterProteine auf Interaktion
- Identifizierung unbekannter interagierender Proteine
- Kartierung von Bindungsdomänen
Was sind die wichtigesten Vorteile des Yeast-two-hybrid Systems?
- technisch einfach und schnell
- prinzipiell für jeden Organismus anwendbar
- unabhängig von der in der Zelle vorliegenden Proteinmenge
- erlaubt den Nachweis schwacher und temporärer Wechselwirkungen
Was sind die wichtigesten Nachteile des Yeast-two-hybrid Systems? Was resultiert aus diesen?
- nicht jede Interaktion nachweisbar
- Gewebe- oder entwicklungsspezifische Expression der Proteine wird nicht wahrgenommen
⇒ Ergebnisse einer Yeast-two-hybrid Untersuchung müssen durch andere Methoden weiter untersucht werden
Was sind die Abwandlungen des Yeast-two-hybrid Systems? Wofür werden sie verwendet?
- One-Hybrid-System
- Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte DNA-Sequenz binden
- Promotor entspricht Bait
- Three-Hybrid-System
- Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte RNA-Sequenz binden
- “falsche” Three-Hybrid-System
- Untersucht welches Protein zwischen zwei anderen Vermittelt
