Protein-Techniken Flashcards
Was sind rekombinante Proteine?
Rekombinante Proteine sind biotechnologisch hergestellte Proteine, die in der Regek in einer Wirtszelle hergestellt werden
In welchen Bereichen finden rekombinatne Proteine eine Anwendung?
- Industrielle Nutzung (bsp. Waschmittel- und Lebensmittelindustrie)
- Diagnostik
- Therapeutische Nutzung
- Wissenschaftliche Forschung
Wie ist der grobe Ablauf für die Herstellung rekombinanter Proteine?
- Vermehrung der gewünschten DNA-Sequenz
- Klonierung in einen geeigneten Expressions-Vektor
- Transformation in den Zielorganismus
- Selektion transgener Organismen
- Kultivierung und Induktion der Expression
- Extraktion von Gesamt-Protein
- Aufreinigung des gewünschten Proteins
Welche Arten von Expressionssytemen gibt es? Was sind je zwei Beispiele für ein solches Expressionssystem?
-
prokaryotische Systeme
- E. coli
- Bacillus spec.
-
eukaryotische Systeme
- Hefen
- Insektenzellen
Was sind die Vor-/Nachteile eines prokaryotischen Systems als Expressionsvektor?
Vorteile:
- einfache Handhabung
- schnelles und kontrolliertes Wachstum
- vielfälfig
Nachteile:
- fremde Proteine akkumulieren häufig in “inclusion bodies” ( da sie in sehr großen Mengen exprimiert werden)
- Falsche Faltung möglich
- keine post-Translationalen modifikationen möglich
Was sind die Vor-/Nachteile eines eukaryotischen Systems als Expressionsvektor?
Voteile:
- Expression induzierbar
- hohe Ausbeuten
- einfach Handhabung bei Hefe
Nachteile;
- Insektenzellen komplexer n der Handhabung
- post-Translationale Modifikation in Hefen nur zum Teil möglich
- Glykolisierungsmuster abweichend von anderen Systemen
Was versteht man unter der Induzierbarkeit der Proteinexpression?
Die Gene werden hinter einen indzierbaren Promotor geschaltet. So lässt sich die Expression der Proteine regulieren.
Was versthet man unter in vitro Experssionsystemen? Wann verwendet man sie?
- Expression eines Gens findet nicht in einer Zelle sondern in einem Reaktionsgefäß statt
- Alle notwendigen Bestandteile werden in das Reaktionsgefäß gegeben, sodass die Reaktion abläuft
⇒ Wird verwendet wenn sowohl proaryotische, als eukaryotische Expressionssyteme versagenw
Welche Methoden des Zellaufschlusses für die Protein-Extraktion gibt es?
- Potter
- Mixer
- Ultraschallbad
- Kugelmühle
- Frensch Press
Was sind die notwendigen Schritte zur Herstellung von Protein-Roh-Extrakten?
- Zell-aufschluss
- Zell-Trümmer abzentrifugieren und Überstand abnehmen
- Proteingehalt bestimmen und Probe lagern (-20°C bis -80°C)
Wie funktioniert die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford?
- Bradford-Reagenz mit Proteinlösung mischen
- inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur
- photometrische Messung
- Konzentration anhand einer Protein-Eichgraden bestimmen
Was ist eine SDS-Page? Wozu dient SDS?
- Methode zum Auftrennen von Proteinen anhand ihrer Größe (Analog zur Gelelktrophorese von DNA)
- SDS bindet an Polypetidketten und löst die tertiär und quartär Struktur von Proteinen auf
- Außerdem: negativ geladene Kopfregion ermöglich Wanderung im elektrischen Feld des SDS-Page
Aus welchen beiden Bereichen setzt sich das bei der SDS-Page verwendete Gel zusammen? Was ist deren Funktion?
- Sammelgel
- Fokusiert “Proteinschmir” auf einer Bande
- Trenngel
- Trennt untershciedlichen Proteine auf
Durch welche beiden Stoffe können die Banden einer SDS-Page sichtbar gemacht werden? Wo liegt die jeweilige Nachweisgrenze?
- Comassie(brilliant-blue)-Färbung
- Nachweisgrenze bei 300 ng/Bande
- Silbernitrat-Färbung
- Nachweisgrenzene bei 10 ng/Bande
Was ist das Prinzip einer 2D-Gelektrophorese?
- Auftrennung nach der Größe der Proteine (vertikal) und ihrem isoelektischen Punkt (horizontal)
- gibt erste Aufschlüsse über die Eigenschaften des Proteins
Welche zwei Arten von Antikörpern gibt es? Worin untersicheiden sie sich?
-
monoklonale Antikörper
- Hochspezifisch → erkennen nur einen ganz bestimmten Teil eines Proteins
-
polyklonale Antikörper
- Mischung aus mehren Antikörpern die jeweils verschiedene Teile ein und des selben Proteins erkennen
