Transgene Organismen

Question 1

Was versteht man unter einem transgenen Organismus?

Answer 1

“Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt”

Question 2

Was versteht man in der Gentechnik unter dem Begriff der Transformation?

Answer 2

Einbringen von genetischen Informationen in Organismen

Question 3

Was ist das Grundbrinzip der Transormation?

Answer 3

DNA → Vektor → Übertragungsweg → Zielorgan(ismus)

Question 4

Was für Arten der Transformation gibt es? Wie unterscheiden sie sich im Bezug auf die lokalisation, vererbung und Expression?

Answer 4

• stabile Transformation
  
  • integration in das Genom des Empfängers
  • wird weiter vererbt
  • dauerhafte Expression, aber i.d.R nur eine Kopie
• transiente Expression
  
  • Einbringen in Cytoplasma des Empfängers
  • nicht vererbt
  • nur für kurzen Zeitraum exprimiert, aber i.d.R Überexpression (→ viele Genkopien)

Question 5

Welche Methoden gibt es um eine stabile Transformation zu erreichen?

Answer 5

• Integration durch nicht-homologe Rekombination
• Integration durch homologe Rekombination
• Partikelbombardierung und Rekombination (Pflanzen)
• T-DNA vermittelte Transformation (Pflanzen)

Question 6

Bei der stabilen Transformation durch ____________________________ wird die Fremd-DNA an einer zufälligen Stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

Answer 6

Bei der stabilen Transformation durch nicht-homologe Rekombination wird die Fremd-DNA an einer zufälligen Stelle im Genom eingebaut.

Question 7

Bei der stabilen Transformation durch ______________________ wird die Fremd-DNA gezielt an einer bestimmten stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

Answer 7

Bei der stabilen Transformation durch homologe Rekombination wird die Fremd-DNA gezielt an einer bestimmten stelle im Genom des Empfängers eingebaut.

Question 8

Welche Methoden gibt es für die transiente Expression?

Answer 8

• Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen
• Agrobakterien (Pflanzen)
• Partikelbombardierung (Pflanzen)

Question 9

Welches Bakterien taxon spielt eine wichtige Rolle in pflanzlichen Gentechnick? Warum?

Answer 9

⇒Agrobakterien

⇒ besitzen ein Ti-Plasmid, welches einen Vektor zum stabilen transormieren von Pflanzen darstellt

Question 10

Welche Region des Ti-Plasmids ist entscheident für seine Funktion als Vektor? Wie ist diese aufgebaut? Wie kann sie für die Gentechnick nutzbar gemacht werden?

Answer 10

⇒ T-Region (transfer-Region)

• T-Region besteht aus einer rechten und linken Grenze und der dazwischen ligenden T-DNA (transfer-DNA)
• Wildtyp-DNA aus der T-Region kann ausgetauscht werden, solange die Grenzen der T-Region nicht verändert werden

Question 11

Was sind Nachteile an der T-DNA vermittelten transformation?

Answer 11

• Agrobakterium kann (eigentlich) nur dikotyle Pflanzen infizieren → meisten Nutzpflanzen jedoch monokotyl
• auschließlich nicht-homologer Einbau der T-DNA in Genom des Empfängers

Question 12

Wie erfolgt die T-DNA vermittelte Transformation von Pflanzenzellen?

Answer 12

1. Austausch der Wildtyp-T-DNA mit modifizierter T-DNA
2. Einbringen des Ti-Plasmids in Agrobakterien
3. Infektion von Pflanzenzellen mit Agrobakterium
4. Zellkultur von infizierten Pflanzenzellen präperirten Nährmedien für die Selektion der Zellkulturen
5. Züchten einer transgene Pflanze aus Zellkulturen

Question 13

Wie ist modifizierte T-DNA aufgebaut?

Answer 13

1. Linke Grenze
2. Gen inkl. Promotor und Terminator
3. Selektionsmarker
4. Rechte Grenze

Question 14

Wie kann Arabidopsis leicht mittels T-DNA transformiert werden? Wie hoch ist etwa die Transformationsrate?

Answer 14

1. Wenn die ersten Blüten blühen → “dipping” der Blüten in Agrobakterium-Lösung
2. Kultivierung der Pflanze in Aufzuchtschrank (2-3 Wochen)
3. Samen Reifung und Trocknung
4. Selektion der transformierten Samen auf Nährmedium

⇒ Transformationsrate etwa 1%

Question 15

Wie ist die Ausgangssituation im “Postgenomics”-Zeitalter?

Answer 15

Zwar viele Genomsequenzen bekannt, aber ein Großteil der Funktionen von Genen ist unbekannt

Question 16

Wofür kann Transformation in der Pflanzenforschung angewandt werden? (beispielhaft)

Answer 16

• Promotor-Reportergen-Fusion
• Protein-Reportergen-Fusion
• Struktut-Funktions-Untersuchung
• Über-Expression von Genen

Question 17

Was versthet man unter der Promotor-Reportergen-Fusion? Wofür verwendet man sie?

Answer 17

• Auf einen Promotor folgt nicht mehr das Gen welches er eigentlich reguliert, sondern ein Markergen
• Gibt Aufschlüsse darüber, wo in einem Organismus ein Gen exprimiert wird
• Das funktionelle Gen bleibt erhalten. Es wird nur eine zusätzliche Kopie hinzugefügt

Question 18

Was versteht man unter Protein-Reporterprotein-Fusion? wofür wird sie verwendet?

Answer 18

• Anbringen eines flureszierendes Proteins an Gen
• Gleiche verwendung wie bei Promotor-Reporterprotein-Fusion

Question 19

Was versteht man unter dem biolistic DNA transfer? Welche Art(en) der Transformation kann erreicht werden?

Answer 19

• Fremd-DNA wird auf kleine Metallkugeln aus Gold / Wolfram gebracht und mittels einer Gen gun in Empfängerorganismen “geschossen”
• Auf jeden fall transiente Transformation, mit geringer Wahrscheinlichkeit auch stabile

Question 20

Was ist der Vorteil/Nachteil an der Transformation von Plastiden?

Answer 20

Vorteile

• Große Expressionsmengen
• nur mütterlich vererbt → alle Tochterpflanzen auch transformiert
• homologe Rekombination

Nachteil

• Aufwendig zu selektieren auf Grund der hohen Anzahl an Plastiden

Question 21

Was versteht man unter “forward genetics”? Was ist bekannt/ unbekannt vor der Untersuchung?

Answer 21

• Funktionsaufklärung von Genen und ihrer Produkte durch die Betrachtung vom Phänotyp zum Genotyp
• Sequenz unbekannt
• Funktion bekannt

Question 22

Was ist die Vorgehensweise der forward gentics?

Answer 22

1. Isolierung einer interessanten Mutante
2. Gezielte Kartierung und isolation es verantwortlichen Gens

Question 23

Was versteht man unter der “reverse Genetics”? Was ist bekannt/unbekannt zu Beginn der Untersuchung?

Answer 23

• Funktionsaufklärung von Genen und ihrer Produkte durch die Betrachtung von Genotyp zum Phänotyp
• Sequenz bekannt
• Funktion unbekannt

Question 24

Was sind die zwei grundlegenden Möglichkeiten bei der reverse genetics?

Answer 24

• gerichte Mutagenese ( gezielte Mutation eines Gens von Interesse)
• zufällige Mutagenese (zufällige Mutationen von Genen)

Question 25

Wie ist die vorgehensweise der reverse genetics?

Answer 25

1. Gen mutieren (oft mal knock-out des Gens)
2. Untersuchung des Phänotyps

Question 26

Was sind Operationen der reverse genetics?

Answer 26

• Rekombination
• T-DNAinsertions-Mutagenese
• Transponsible elements
• CRISPR/Cas9

Question 27

Wie können Gene gezielt durch homologe-Rekombination in Hefe inaktiviert werden?

Answer 27

1. Desing von Primern welche je eine homologe Sequenz für das Zielgen, als auch den Selektivenmarker haben
2. PCR des Gens des Selektierbarenmarkers mit den vorher designten Primern
3. Einbringen der Sequenz in Hefe
4. Homologe Rekombination mit Zielgen in der Hefe → eine der beiden Genkopien verändert
5. Bildung 4 haploider Sporen
6. Selektion durch Selektierbarenmarker

Question 28

Wie könne Gene durch homologe Rekombination in höheren Eukaryoten (z.B Mäusen) ausgeschaltet werden?

Answer 28

1. Blastocyten werden embryonische Stammzellen (ES) entnommen
2. Target-Gen wird in die ES eingebracht
3. ES in Zellkulturen vermehrt
4. Selektion der Zellen bei denen der Einbau homolog stattgefunden hat (andere Karte)
5. Diese Zellen in Blastocyt eines Wild-Typ-Organismus einbringen
6. Einsetzen des Blastocyten in Mutter

Question 29

Wie können die embroytischen Stammzellen höherer Eukaryoten (z.B Mäuse) darauf hin selektiert werden, ob der Einbau des Target-Gens homolog/nicht-homolog stattgefunden hat? Wie ist hierfür das Repalcement-Konstrukt aufgebaut

Answer 29

Aufbau des Replacement-Konstrukts:

• enthält zwei selektierbare Marker und die Sequenz des Gens welches ersetzt werden soll
• eine der Ressistenzen innerhalb dieser Sequenz → Knock-out des Gens
• anderer selektierbarer Marker hinter der Gensequenz

Ablauf der Selektion:

• Nicht-homologe Rekombination:
  
  • Einbau des gesamten Replacement-Vektors im Genom der ES → beide Ressistenzen aktiv
• homologe Rekombination:
  
  • nur der Teil des Replacement-Vektors wird eingebaut, welcher die Sequenz des Gens und des einen selektierbaren Markers besitzt → nur eine Ressitenz aktiv

⇒ Selektion möglich

Question 30

Wie können Transgene Mäuse durch zufällige integration von Fremd-DNA hergestellt werden?

Answer 30

1. Injektion der Fremd-DNA in einen der beiden Pronuclei (männlicher/weiblicher Kern in einer Eizelle vor der Fusion)
2. Einbringen der Zygote in Leihmutter
3. 10-30% der Nachkommen tragen Fremd-DNA im Genom
4. Züchten der Nachkommen

Question 31

Wofür verwendet man das Cre-Lox-System?

Answer 31

• Herstellung Gewebe-spezifischer Knock-outs
• Knock-outs nur zu bestimmten Zeiten in der Entwicklung

Question 32

Aus welchen Komponenten besteht das Cre-Lox-Sytem? Wozu dienen sie?

Answer 32

1. LoxP-DNA-Sequenzen
   
   • flankieren/markieren das Zielgen in jeder Zelle des Organismus
2. Cre-Rekombinase
   
   • entfernt den Bereich der DNA, welcher doch die Lox-Gene markiert wurde durch Rekombination
   • Ort der Expression der Cre-Rekombinase kann frei bestimmt werden → Gewebe-spezifische Knock-outs möglich
   • Stattdessen: Expression eines Reportergens

Question 33

Wie kann mit Hilfe von T-DNA die Funktion von Genen unteruscht werden?

Answer 33

• T-DNA wird zufällig vor, in oder hinter einem Gen eingebaut
• jenachdem wo sie eingebaut wird kann sie die Funktion/Expression verändern

Question 34

Was sind Transposons?

Answer 34

DNA Elemente die die Fähigkeit haben sich im Genom zu bewegen

Question 35

Wie könne Transposon-induzierte Mutanten Aufschluss über die Funktion von Genen geben?

Answer 35

• Werden entweder vor, in oder hinter dem Zielgen eingebaut
• je nachdme wo sie eingebaut werden kann sich die Funktion/Expression der Gene ändern

Question 36

Wieunterscheiden sich T-DNA-inuduzierte Mutanten von Transposon-induzierten Mutanten

Answer 36