Methoden der Gentechnik

Question 1

Was sind die Grundlegenden Schritte der DNA-Isolation?

Answer 1

1. Lyse der Zellen
2. Zentrifugieren zum Entfernen der Zelltrümmer
3. Phenolextraktion zum Abtrennen von Proteinen
4. Ethanolfällung von Nukleinsäuren
5. Reinigung von DNA an Silikat- und Aniontauchsäulen

Question 2

Mit welchem Stoff wird DNA sichtbar gemacht?

Answer 2

Ethidiumbromid

Question 3

Was für einen Einfluss hat die Agarosekonzentration bei der Separation von DNA-Fragmente?

Answer 3

Je kleiner die aufzutrennenden Fragmente sind desto höher muss die Agarosekonzentration sein.

Question 4

Wozu dient ein southern Blot?

Answer 4

Dem spezifischen Nachweis von DNA-Fragmenten.

Question 5

Wie geht man bei einem southern Blot vor?

Answer 5

1. DNA mit Resrtiktionenzymen verdauen
2. Gelektrophorese der DNA-Fragmente
3. Übertragung der DNA-Fragmente auf Nitrocellulose
4. Hybridisierung zum Nachweis des gesuchten DNA-Fragmentes

Question 6

Wie wird bei einem souther Blot die DNA von dem Agarosegel aus die Nitrocellulose übertragen?

Answer 6

Das Gel wird in eine alkalische Lösung gelegt. Darauf kommt Filterpapier und Nitrocellulose. Über Kapilarkräfte transportiert die Lösung die DNA-Fragmente auf die Nitrocellulose.

Question 7

Wozu dient ein ein Nothern Blot?

Answer 7

Dem spezifischen Nachweis von RNA-Fragmenten

Question 8

Was sind zwei Methoden zur radioaktiven Markierung der DNA durch Polymerasen?

Answer 8

Nick-translation

end labeling

Question 9

Wie erfolgt die radioaktive Markierung bei der Nick-Translation?

Answer 9

Die einzelstränigen Lücken die während der DNA-Replikation entstehen werden mit radioaktiv markierten Nukleotiden durch die DNA-Polymerase I aufgefüllt.

Question 10

Wie erfolgt die radioaktive Markierung bei der end labeling Methode?

Answer 10

Sticky-ends von DNA-Fragmenten werden durch das Klenow-Fragment mit radioaktiv markierten Nukleotiden aufgefüllt.

Question 11

Wie funktioniert der Nachweiß von Nukleinsäuren durch Hybridisierung?

Answer 11

1. Doppelsträngige DNA denaturieren und aud Filter fixieren
2. Inkubieren mit markierter einzelsträniger DNA
3. Waschen um nicht gepaarte Einzelstränge zu entfernen
4. Autoradiographie

Question 12

Was sind die Schritte beim Nachweis von Nukleinsäuren durch Kolonie-Hybridisierung?

Answer 12

1. Übertragen der Kolonien auf Nitrocellulose / Nylon
2. Abbau der Zellen
3. Reinigung der DNA
4. Hybridisierung mit markierter DNA
5. Autoradiographie

Question 13

Was versteht man unter Oligonukleotiden (in vitro)?

Answer 13

synthetisierte einzelstränige DNA Fragmente von meist ca. 20 Nukleotiden (im Normalfall ohne 5’-Phosphat)

Question 14

Wo zu können Oligonukleotide verwendete werden?

Answer 14

Primer für random priming, primer extension oder PCR

Falls doppelsträngig:
Linker
Adaptoren

Question 15

Was sind Linker?

Answer 15

Oligonukleotide, die eine Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms beinhalten

Question 16

Wofür werden Linker verwendet?

Answer 16

Linker werden an DNA-Moleküle mit glattem Ende angefügt und anschließend mit dem entsprechendem Restriktionsenzym verdaut → DNA-Molekül mit sticky-end

Question 17

Wie werden Oligonukleotide synthetisiert?

Answer 17

1. Startnukleotid ist an Glasmatrix gebunden und die 5’-OH-Gruppe ist frei
2. Folgenukleotid ist am 5’-Ende mit Schutzgruppe verbunden. 3’-Ende mit hochreaktiver Phosphatgruppe → reaktion mit Startnukleotid
3. Entfernung der Schutzgruppe & Stabilisierung des Phosphates durch Oxidation
4. weiter Reaktionen nach diesem Schema
5. Ende durch finale Entfernung der Methylgruppe

Question 18

Was sind die drei Phasen einer PCR?

Answer 18

Denaturierung, Annealing, Elongation

Question 19

Was ist ein Template?

Answer 19

Substrat der PCR-Reaktion

Question 20

Was ist ein Primer?

Answer 20

kurze Oligonukleotide zur Initiation der Polymerisation

Question 21

Was sind dNTPs?

Answer 21

Nukleotidtriphosphate

Question 22

Was passiert bei der Denaturierung?

Answer 22

Trennung der Doppelstränge

Question 23

Was passiert bei dem Annealing?

Answer 23

Anlagerung der Primer an dem geöffneten Doppelstrang

Question 24

Was passiert bei der Elongation?

Answer 24

Neusynthese der fehlenden Doppelstranges

Question 25

Wie ist der Ablauf einer typischen PCR (inklusive Temperaturen)?

Answer 25

1. Denaturierung bei 95°C
2. Annealing bei 55°C
3. Elongation bei 72°C

Question 26

Was bezeichnet man als RT-PCR?

Answer 26

Kombination aus molekularbiologischen Methoden: Reverse Transkription und PCR → Dient dem Nachweis von RNA (bsp. Genaktivität)

Question 27

Was sind die Schritte der RT-PCR?

Answer 27

1. Reverse Transkription von der zu untersuchenden RNA

2. PCR mit dem DNA-Produkt der reversen Transkriptase