Methoden der Gentechnik Flashcards
Was sind die Grundlegenden Schritte der DNA-Isolation?
- Lyse der Zellen
- Zentrifugieren zum Entfernen der Zelltrümmer
- Phenolextraktion zum Abtrennen von Proteinen
- Ethanolfällung von Nukleinsäuren
- Reinigung von DNA an Silikat- und Aniontauchsäulen
Mit welchem Stoff wird DNA sichtbar gemacht?
Ethidiumbromid
Was für einen Einfluss hat die Agarosekonzentration bei der Separation von DNA-Fragmente?
Je kleiner die aufzutrennenden Fragmente sind desto höher muss die Agarosekonzentration sein.
Wozu dient ein southern Blot?
Dem spezifischen Nachweis von DNA-Fragmenten.
Wie geht man bei einem southern Blot vor?
- DNA mit Resrtiktionenzymen verdauen
- Gelektrophorese der DNA-Fragmente
- Übertragung der DNA-Fragmente auf Nitrocellulose
- Hybridisierung zum Nachweis des gesuchten DNA-Fragmentes
Wie wird bei einem souther Blot die DNA von dem Agarosegel aus die Nitrocellulose übertragen?
Das Gel wird in eine alkalische Lösung gelegt. Darauf kommt Filterpapier und Nitrocellulose. Über Kapilarkräfte transportiert die Lösung die DNA-Fragmente auf die Nitrocellulose.
Wozu dient ein ein Nothern Blot?
Dem spezifischen Nachweis von RNA-Fragmenten
Was sind zwei Methoden zur radioaktiven Markierung der DNA durch Polymerasen?
Nick-translation
end labeling
Wie erfolgt die radioaktive Markierung bei der Nick-Translation?
Die einzelstränigen Lücken die während der DNA-Replikation entstehen werden mit radioaktiv markierten Nukleotiden durch die DNA-Polymerase I aufgefüllt.
Wie erfolgt die radioaktive Markierung bei der end labeling Methode?
Sticky-ends von DNA-Fragmenten werden durch das Klenow-Fragment mit radioaktiv markierten Nukleotiden aufgefüllt.
Wie funktioniert der Nachweiß von Nukleinsäuren durch Hybridisierung?
- Doppelsträngige DNA denaturieren und aud Filter fixieren
- Inkubieren mit markierter einzelsträniger DNA
- Waschen um nicht gepaarte Einzelstränge zu entfernen
- Autoradiographie
Was sind die Schritte beim Nachweis von Nukleinsäuren durch Kolonie-Hybridisierung?
- Übertragen der Kolonien auf Nitrocellulose / Nylon
- Abbau der Zellen
- Reinigung der DNA
- Hybridisierung mit markierter DNA
- Autoradiographie
Was versteht man unter Oligonukleotiden (in vitro)?
synthetisierte einzelstränige DNA Fragmente von meist ca. 20 Nukleotiden (im Normalfall ohne 5’-Phosphat)
Wo zu können Oligonukleotide verwendete werden?
Primer für random priming, primer extension oder PCR
Falls doppelsträngig:
Linker
Adaptoren
Was sind Linker?
Oligonukleotide, die eine Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms beinhalten
Wofür werden Linker verwendet?
Linker werden an DNA-Moleküle mit glattem Ende angefügt und anschließend mit dem entsprechendem Restriktionsenzym verdaut → DNA-Molekül mit sticky-end
Wie werden Oligonukleotide synthetisiert?
- Startnukleotid ist an Glasmatrix gebunden und die 5’-OH-Gruppe ist frei
- Folgenukleotid ist am 5’-Ende mit Schutzgruppe verbunden. 3’-Ende mit hochreaktiver Phosphatgruppe → reaktion mit Startnukleotid
- Entfernung der Schutzgruppe & Stabilisierung des Phosphates durch Oxidation
- weiter Reaktionen nach diesem Schema
- Ende durch finale Entfernung der Methylgruppe
Was sind die drei Phasen einer PCR?
Denaturierung, Annealing, Elongation
Was ist ein Template?
Substrat der PCR-Reaktion
Was ist ein Primer?
kurze Oligonukleotide zur Initiation der Polymerisation
Was sind dNTPs?
Nukleotidtriphosphate
Was passiert bei der Denaturierung?
Trennung der Doppelstränge
Was passiert bei dem Annealing?
Anlagerung der Primer an dem geöffneten Doppelstrang
Was passiert bei der Elongation?
Neusynthese der fehlenden Doppelstranges
Wie ist der Ablauf einer typischen PCR (inklusive Temperaturen)?
- Denaturierung bei 95°C
- Annealing bei 55°C
- Elongation bei 72°C
Was bezeichnet man als RT-PCR?
Kombination aus molekularbiologischen Methoden: Reverse Transkription und PCR → Dient dem Nachweis von RNA (bsp. Genaktivität)
Was sind die Schritte der RT-PCR?
- Reverse Transkription von der zu untersuchenden RNA
2. PCR mit dem DNA-Produkt der reversen Transkriptase
