Transfektion Flashcards
Vad är syftet med transfektion?
- Uttrycka ett fusionsprotein (och mRNA)
- Studera ett proteins funktion i en viss cell
- Studera genuttryck och dess reglerelement
Vilka celler kan transfektion utföras på?
- Bakterier
- Jäst
- Insektsceller
- Djurceller
- Humana celler
Det finns två “typer” av transfektioner av DNA (i mammalieceller). Vilka och vad innebär de?
- Transienta transfektioner - genexpression från plasmid i 2-4 dagar (plasmid-DNA replikeras ej i cellen)
- Stabila transfektioner - genen integreras i kromosomernai en vecko-lång process.. Sker väldigt sällan och sker slumpmässigt. Man får selektera fram i efterhand med selektionsmarkörer (neomycin eller hygromycin). Selektionsmarkörerna kan vara typ resistensgener och antibiotika.
Vilka olika former av transfektion finns hos eukaryota celler?
- Kalciumfosfat - kräver väldigt rent DNA och även ganska svårt att utföra
- Polykatjoner (DEAE-dextran, PEI) - positiva komplex som binder till negativt DNA
- Elektroporering - elektrisk puls skapar transienta “hål” i cellmembranet - många celler dör!
- Liposomer / lipid-medierad transfektion - främst för snabbväxande celler, till både stabila och transienta transfektioner. Låg grad av celltoxicitet
- Gene gun, microinjektion, laser, ultraljud
- Virus (transduktion)
Vad är kalciumfosfat transfektion?
- Precipitetar (fäller ut) DNA på cellerna
- Används främst till fastväxande cellinjer
- Kan användas till både stabila och transienta transfektioner - speciellt effektiv för stabila
- Kräver hög kvalitet på plasmid-DNA (rent!)
Vad är elektroporering och när är det bra att använda?
- Elektrisk puls skapar transienta “hål” i cellmembranet
- En bra metod för celler som växer i suspension
- Celler som inte går att transfektera med kemiska metoder kan gå att transfektera med hjälp av elektroporation
Vilka krav finns på plasmiden?
- Kloning och replikation i bakterier (DNA-prep)
- Uttryck av gen med tillhörande element i eukaryota eller (promotor, origin of replikation, green fluoroescent protein, resistensmarkörer och selektionsmarkör)
- Selektionsmarkör behövs för att virus-plasmiden ska kunna kännas igen i bakteriens DNA
- Origin of replikation behövs då vi transformerar in viruset, så det kan replikeras i en bakterie
Gällande uttryck på mRNA nivå kan transkriptsmängden kontrolleras med vad?
- qPCR
- RNAseq
- Array
- Northern blot
När används rekombinanta proteiner och transfektion?
- Funktionella in vitro studier
- Strukturanalys
- Läkemedelstillverkning
- Livsmedelindustrin
- Promotorstudier / genreglering
Översiktligt, vad är principen bakom promotorstudier / genreglering?
Genen byts mot en reportergen som inte uttrycks endogent och därmed inte kan påverka cellens biologi
Varför är promotorstudier / genreglering där genen byts ut mot en reportergen bra?
- Har hög känslighet och låg bakgrund
- Metoden är en enkel, snabb och billig analys
- Kan ge kvantitativt mått på promotoraktivitet (linjärt intervall)
Ge exempel på reportergener som kan användas istället för “vanlig” gen vid promotorstudier / genreglering?
- CAT (kloramfenikolacetyltransferas)
- B-galaktosidas
- Luciferas
Vid promotorstudier / genreglering kan man använda sig av en deletionsserie. Hur fungerar det?
Man använder massa aktivatorer / repressorer och initeringskomplex i olika kombinationer för att studera effekten hos promotorsekvenser
Vad är erytropoetin, EPO?
Ett hormon som hjälper kroppen att producera fler röda blodkroppar, som i sin tur ökar transporten av syre och CO2
Vad händer om man har höga halter av EPO i kroppen?
Höga halter ger visköst blod och ökad risk för blodproppar
