PCR, sekvensering och NGS

Question 1

Vilken är den grundläggande principen för PCR?

Answer 1

Amplifiering av bestämd DNA-sekvens så att den kan detekteras

Question 2

Vilka är de tre stegen i PCR och vid vilken temperatur sker dem?

Answer 2

• Denaturing stage - 95C
• Annealing stage - 55-65C
• Extending stage - 72C

Question 3

Ibland får man korta sekvenser som amplifierats i PCR i mindre utsträckning än den sökta genen. Vad beror detta på?

Answer 3

• Den sökta genen amplifieras exponentiellt
• De andra sekvenserna amplifieras endast några gånger, i specifika fall, och har en linjär amplifiering

Question 4

Vilka är de ingående komponenterna i en PCR-reaktion?

Answer 4

• Taq polymeras (syntetiskt DNA-polymeras)
• PCR buffer (pH, monovalent jonbuffert)
• Specifika PCR primers - forward and reverse primer
• dNTP - fria nukleotider
• Magnesium-joner - co-faktor för att dNTP ska kunna binda till Taq-polymeras

Question 5

Hur påverkas primer-inbindning av för höga, respektive för låga temperaturer i PCR?

Answer 5

• För hög - primern blir för rörlig och binder inte in
• För låg - primern blir inte tillräckligt rörlig och blir därmed ospecifik

Question 6

Hur lång är oftast en PCR-primer?

Answer 6

20-22 baspar lång

Question 7

Redogör för Sanger-metoden fungerar?

Answer 7

• 1/100 nukleotider färgas in med fluorokromt ämne
• Nukleotiderna kopplas på DNA-strängen en och en, som i vanlig PCR
• Om den påkopplade nukleotiden har ett färgämne på sig, är sekvensen “klar” och elongeringen termineras. Vid nästa cykel kommer alltså denna sekvens inte förlängas längre
• Alla sekvenser filtreras ut med kapillär-gelelektrofores och de hamnar i storleksordning
• Avläsning sker

Question 8

Om du har en punktmutation, hur vet du om den är farlig eller inte?

Answer 8

Det beror på aminosyraförändringen

Om det blir frameshift, non-sense, ett stoppkodon, blah blah

Question 9

Varför vill man titta på DNA-förändringar?

Answer 9

• Cancer
• Genetiska sjukdomar
• Patogener - virus och mikroorganismer
• Rättsmedicin
• Immunologi - autoimmuna sjukdomar
• Evolution
• Variationer kopplade till dagligt liv

Question 10

Vilka sorters DNA-variationer kan förekomma i cancer?

Answer 10

• Kromosomförändringar
• Deletioner
• Insertion
• Punktmutationer

Question 11

Vad innebär följande:

• Duplikation
• Inversion
• Deletion
• Insertion
• Translokation

Answer 11

• Duplikation - en del blir fel och sätts in flera gånger
• Inversion - platsbyte av kromosomdelar
• Deletion - en del av kromosomen tas bort
• Insertion - en bit hoppar över till en annan kromosom
• Translokation - en kromosomdel hamnar på fel plats / byter plats

Question 12

Vilka cancertyper behandlas effektivt med immunoterapi?

Answer 12

Cancertyper med hög mutationsgrad, ex. melanom

Question 13

Vad är den grundläggande principen för NGS?

Answer 13

Sekvensering av flera DNA sekvenser parallellt

Question 14

Vilka NGS-tekniker finns det som vi kan använda och när?

Answer 14

• Riktad sekvensering (väljer ut intressanta gener eller delar av gener)
• Exom sekvensering (protein-kodande DNA)
• Helgenom sekvensering (allt DNA)

Question 15

Vad är ett exom?

Answer 15

Består av alla genomets exon

Question 16

Vad står NGS för?

Answer 16

Next Generation Sequencing

Question 17

Vad är skillnaden på primers i traditionell PCR och primers i NGS?

Answer 17

I traditionell PCR flyter primers fritt i provet du använder

I NGS sitter de fast på en yta (fast fas)

Question 18

Vad används adapter sequence till i NGS?

Answer 18

Används för att få inbidning av DNA av intresse och din yta, innehållande primers

Question 19

Hur kan man mäta flera prover och sekvenser samtidigt med NGS?

Answer 19

Det läggs till en sample index, alltså en unik sekvens på 6 baspar som används som patient ID

Question 20

När är ligering bra att använda, vid NGS?

Answer 20

När man vill titta på allt DNA istället för att använda en specifik PCR-primer för en sekvens

Helgenom sekvensering

Question 21

Hur går exom-sekvensering till?

Answer 21

• DNA slåss sönder
• Gör primers för kodande DNA
• Länkar samman dessa
• Erhåller ett sequencing library

Question 22

När är det fördelaktigt att använda maskiner som kan analysera långa sekvenser?

Answer 22

Om man vill titta på organismer med okänt DNA

Kan ha många repetetiva sekvenser, svårt att pussla ihop dessa om de är mindre pusselbitar