PCR, sekvensering och NGS Flashcards
Vilken är den grundläggande principen för PCR?
Amplifiering av bestämd DNA-sekvens så att den kan detekteras
Vilka är de tre stegen i PCR och vid vilken temperatur sker dem?
- Denaturing stage - 95C
- Annealing stage - 55-65C
- Extending stage - 72C
Ibland får man korta sekvenser som amplifierats i PCR i mindre utsträckning än den sökta genen. Vad beror detta på?
- Den sökta genen amplifieras exponentiellt
- De andra sekvenserna amplifieras endast några gånger, i specifika fall, och har en linjär amplifiering
Vilka är de ingående komponenterna i en PCR-reaktion?
- Taq polymeras (syntetiskt DNA-polymeras)
- PCR buffer (pH, monovalent jonbuffert)
- Specifika PCR primers - forward and reverse primer
- dNTP - fria nukleotider
- Magnesium-joner - co-faktor för att dNTP ska kunna binda till Taq-polymeras
Hur påverkas primer-inbindning av för höga, respektive för låga temperaturer i PCR?
- För hög - primern blir för rörlig och binder inte in
- För låg - primern blir inte tillräckligt rörlig och blir därmed ospecifik
Hur lång är oftast en PCR-primer?
20-22 baspar lång
Redogör för Sanger-metoden fungerar?
- 1/100 nukleotider färgas in med fluorokromt ämne
- Nukleotiderna kopplas på DNA-strängen en och en, som i vanlig PCR
- Om den påkopplade nukleotiden har ett färgämne på sig, är sekvensen “klar” och elongeringen termineras. Vid nästa cykel kommer alltså denna sekvens inte förlängas längre
- Alla sekvenser filtreras ut med kapillär-gelelektrofores och de hamnar i storleksordning
- Avläsning sker
Om du har en punktmutation, hur vet du om den är farlig eller inte?
Det beror på aminosyraförändringen
Om det blir frameshift, non-sense, ett stoppkodon, blah blah
Varför vill man titta på DNA-förändringar?
- Cancer
- Genetiska sjukdomar
- Patogener - virus och mikroorganismer
- Rättsmedicin
- Immunologi - autoimmuna sjukdomar
- Evolution
- Variationer kopplade till dagligt liv
Vilka sorters DNA-variationer kan förekomma i cancer?
- Kromosomförändringar
- Deletioner
- Insertion
- Punktmutationer
Vad innebär följande:
- Duplikation
- Inversion
- Deletion
- Insertion
- Translokation
- Duplikation - en del blir fel och sätts in flera gånger
- Inversion - platsbyte av kromosomdelar
- Deletion - en del av kromosomen tas bort
- Insertion - en bit hoppar över till en annan kromosom
- Translokation - en kromosomdel hamnar på fel plats / byter plats
Vilka cancertyper behandlas effektivt med immunoterapi?
Cancertyper med hög mutationsgrad, ex. melanom
Vad är den grundläggande principen för NGS?
Sekvensering av flera DNA sekvenser parallellt
Vilka NGS-tekniker finns det som vi kan använda och när?
- Riktad sekvensering (väljer ut intressanta gener eller delar av gener)
- Exom sekvensering (protein-kodande DNA)
- Helgenom sekvensering (allt DNA)
Vad är ett exom?
Består av alla genomets exon
Vad står NGS för?
Next Generation Sequencing
Vad är skillnaden på primers i traditionell PCR och primers i NGS?
I traditionell PCR flyter primers fritt i provet du använder
I NGS sitter de fast på en yta (fast fas)
Vad används adapter sequence till i NGS?
Används för att få inbidning av DNA av intresse och din yta, innehållande primers
Hur kan man mäta flera prover och sekvenser samtidigt med NGS?
Det läggs till en sample index, alltså en unik sekvens på 6 baspar som används som patient ID
När är ligering bra att använda, vid NGS?
När man vill titta på allt DNA istället för att använda en specifik PCR-primer för en sekvens
Helgenom sekvensering
Hur går exom-sekvensering till?
- DNA slåss sönder
- Gör primers för kodande DNA
- Länkar samman dessa
- Erhåller ett sequencing library
När är det fördelaktigt att använda maskiner som kan analysera långa sekvenser?
Om man vill titta på organismer med okänt DNA
Kan ha många repetetiva sekvenser, svårt att pussla ihop dessa om de är mindre pusselbitar
