Metoder för genuttrycksmätningar Flashcards
Varför analyserar vi genuttryck?
Genuttryck är korrelerat till specifika biologiska processer på cell- och organism-nivå
En förändring av genuttryck är ofta relaterat till sjukdomstillstånd
Vilka frågor vill man svara på med analyser av genuttryck?
- När uttrycks genen? (för utredning av cancersubtyp)
- Varför uttrycks genen? (för utredning av cancersubtyp)
- Till vilken grad uttrycks genen?
- Uttrycks relaterade gener på ett korrelativt sätt?
- Hur bra svarar cancerpatienten på behandling?
Vad använder man för att analysera genuttryck?
- Kvalitativ realtids-PCR
- Sekvensering
- Microarrays (äldre metod)
- In situ hybridisering (infärgning i vävnad för att se vart RNA finns)
Varför behöver vi utföra extraktion innan vi kan analysera genuttryck?
- Göra target-strukturen tillgänglig
- Ta bort inhibitorer
- Ta bort fluorescenta föroreningar / autofluorescens
- Bevara target-strukturens integritet - alltså förhindra nedbrytning av RNA och undvika RNAser
- Koncentrera target-sekvensen
Vad beror det på hur kraftig extraktion som krävs?
Det beror på analysmaterialet
Vilka sätt finns för att “ta sönder” och homogenisera sitt prov?
- Mekaniskt - vortexing, sonication, med pipett, skakning
- Fysiskt - frysning
- Enzymatiskt - Proteinas K, Lysozym, Kollagenas
- Kemiskt - guanidinium isothiocynate
Vilka olika reningstekniker kan användas för prep inför genuttrycksanalys?
- Precipitation ⇒ RNA/DNA är negativt laddat och kan därför fällas ut
- Solution based ⇒ fettlöslig fas, vattenlöslig fas
- Membrans-baserad - silicamembran binder upp RNA men släpper igenom allt annat. Därefter utförs tvätt och sist ändras laddningen på membranet för att isolera RNAt
- Magnetic bead based - utformning utifrån det vi analyserar, LURIGT!
Ge exempel på ett RNAse-fritt reagens?
Vatten
Varför är RNAser svåra att ta sönder?
De är värmetåliga / heat stable
Hur kan en kvalitetskontroll av nukleinsyror utföras, för att se hur mycket RNA som extraherats?
- Spektrofotometriskt - absorbans vid 260 nm, och purity (ratio mellan A260 / A280)
- Färgämnen / färgning - kvantifiering genom fluorescens av DNA/RNA-bindande färgämnen
- Elektrofores - 28S och 18S band
Vid omvänd transkription omvandlas RNA till vad?
cDNA
Berätta kortfattat om reverst transkriptas?
- Härstammar från virus
- Uttrycker RNAse aktivitet - kan bryta ner RNA
- Primas av tRNA
Priming av omvänd transkription kan “utföras” på 3 sätt. Vilka?
Vilka två strategier finns för kvantifiering?
- Relativ kvantifiering ⇒ lättare att jämföra
- Absolut / fullständig kvantifiering ⇒ svårt att säga att vi har exakt 323 molekyler, men ungefär. Används för diagnostik
Varför behöver vi “normalisera” värden innan de jämförs med varandra?
Prover som ska jämföras kan ha:
- Olika mängd prov i början av analysen
- Olika utvinningsutbyten
- Olika RT-effektivitet
- Olika grader av inhibition
- Olika kvalitet på RNA/DNA
Hur kan man “normalisera”?
- Massa och volym - ta alltid 1 mg / mL
- Antal celler
- Totalt RNA-mängd
- Uttryck av referens-gener
Mass/volym och andra normaliseringstekniker kompenserar inte för variationer i RNA-kvalitet, RT och PCR-inhibering. Vad används istället?
Referensgener, rRNA
Hur många % av totalt RNA utgör mRNA och rRNA?
mRNA - 2%
rRNA - 90%
Vad är kriteriet för en bra referensgen?
Konstant uttryck i alla prover i studien
Hur fungerar, basically, realtids-PCR?
Den fluoroscenta signalen är proportionell till DNA-mängden / PCR-produkten i provet
Om den fluorescenta signalen från sample A framträder tidigare än signalen från sample B, innebär detta att sample A hade en högre antal initiala kopior än sample B
Det tar alltså färre cykler att nå molekylnivån i sample A än att nå den i sample B
Vad är amplifieringsekvationen?
Vad är strategin för kvantifiering när två samples jämförs med varandra och uttrycket av två gener mäts i varje?
