Metoder att undersöka DNA-protein interaktioner och protein-protein interaktioner Flashcards
Varför vill man undersöka DNA-protein och protein-protein samband?
För att förstå viktiga processer i cellen som exempelvis hur eukaryot DNA replikation eller transkriptionen
Vad är mtDNA?
Ett litet, cirkulärt, dubbelsträngat DNA
Hur många proteiner kodar mtDNA för, och vart används dessa?
mtDNA kodar för 13 proteiner
Alla dessa ingår i andningskedjan
Vad kallas de 2 promotorerna för mtDNA?
LSP
HSP
Vilka är de 2 startställena för DNA-replikation av mtDNA?
OriH and OriL
Vilka är proteinerna involverade i mitokondriell replikation, och vad gör respektive protein?
- Twinkle är ett helikas som öppnar upp det dubbelsträngade DNA:t
- POLGA och POLGB bildar tillsammans ett aktivt DNA-polymeraset som ansvarar för syntes av nya strängar
- mtSSB binder till det enkelsträngade DNA:t och skyddar det
- POLRMT lägger ner primers för att DNA-syntesen ska kunna starta och är även involverad i transkription, och syntetiserar nytt RNA
- TFAM och TFB2M är osäkra, och man vet inte dess exakta funktion
Vilka metoder kan användas när man vill studera interaktioner mellan “kända” proteiner och DNA?
- Footprinting
- Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
- Chromatin immunoprecipitation assays with sequencing (ChIP Seq)
- Isothermal titration calorimetry (ITC), ny metod
- Microscale thermophoresis (MST), ny metod
Vilken metod kan man använda sig av när man vet att ett “okänt” protein binder till ett visst ställe i DNA:t men inte vilket protein det är?
DNA-affinitets kolonn
Vilka metoder kan användas när man vill studera interaktionen av två kända proteiner?
- Gelfiltrering
- EMSA (om något av proteinerna binder DNA)
- Immunoprecipitering (IP)
- Isothermal titration calorimetry (ITC), ny metod
- Microscale thermophoresis (MST), ny metod
Vilka metoder kan användas när man letar efter nya interaktionspartners, gällande protein-protein interaktioner?
- Protein affinitetskolonn
- Immunoprecipitering (IP)
- BioID, ny metod
- Jäst-2-hybrid screening, äldre metod
Vad är fördelen med fraktionering när man vill undersöka funktioner hos proteiner i ett proteinextrakt ur exempelvis vävnad eller celler?
Man får en viss “berikning” av proteinerna som man är intresserad av
Om man vill studera ett protein som finns i mitokondrien kan man med hjälp av fraktionering bli av med proteiner som finns i kärnan och cytoplasman, som man ändå inte är intresserad av
Innan man kör EMSA eller footprinting behöver DNAt inmärkas. Hur går detta oftast till?
DNA:t märks oftast in radioaktivt, e.g. med 32P
Då brukar man märka in 5’-änden på DNA:t med hjälp av [y-32P]ATP och T4-polynukleotidkinas
Idag finns även möjlighet att märka in med fluorescens men detta är inte en lika känslig metod som radioaktivitet
Vad “bygger” EMSA-tekniken på?
Att ett komplex mellan DNA och proteiner vandrar långsammare än fritt DNA i en nativ polyakrylamidgelelektrofores
Vad händer på polyakrylamidgelen vid EMSA?
DNA är negativt laddat och vandrar därför efter storlek mot pluspolen i ett elektriskt fält
När proteiner binder till DNA:t blir komplexet större och vandrar därför långsammare
Vad är uppgiften av POLG?
Det ansvarar för syntesen av det mitokondriella genomet i humana celler
Vad kan EMSA exempelvis användas för?
- Undersöka vilka aminosyror som är nödvändiga i ett protein för att två proteiner ska kunna interagera
- Med hjälp av EMSA kan man även se att det mitokondriella DNA-polymeraset består av flera subenheter
- Det finns mitokondriella sjukdomar met mutationer i de olika subenheterna, och med EMSA kan man undersöka om dessa mutationer påverkar interaktionen av de två subenheterna
- Undersöka om proteiner binder till en viss DNA-sekvens
Vad är skillnaden mellan POLGA och POLGB?
POLGA = är polymeras- och proofreading-faktor
POLGB = är en processivitetsfaktor
Med EMSA kan man undersöka om proteiner binder till en viss DNA-sekvens, men vilken metod används om man vill veta mer exakt var/hur på DNA:t proteinet/proteinerna binder?
Footprinting
Vilka är stegen som ingår i footprinting-metoden?
- Precis som i EMSA, så inkuberar man proteinerna med ett radioaktivt DNA-fragment (200-500bp)
- DNA klyvs med DNase I. Enzymet kan klyva DNA:t på alla ställen förutom där proteinet sitter bundet
- DNase I klyver på olika ställen på olika DNA-molekyler, vilket gör att de blir olika långa
- DNA-molekylerna denatureras och de långa fragmenten körs ut på en denaturerande gel ⇒ bildas en “stege”
- DNase I kan inte ha klyvt där proteinet suttit, vilket innebär att inga DNA-molekyler av den specifika storleken har bildats ⇒ footprint (ett tomt område på gelen)
Vad kan man använda footprinting till? Vad hjälper det oss att förstå?
Används för att förstå hur det mitokondriella transkriptionsmaskineriet binder in till promotorn
Man kan bestämma exakt vart proteinerna binder
Varför är TFAM (mitochondrial transcription factor A) viktigt?
Den fungerar som en rekryterare
TFAM behövs vid promotorn för att rekrytera POLRMT och TFB2M
Om inte den finns så kan inte POLRMT och TFB2M binda till promotorn och initiera transkription
EMSA och footprinting bygger främst på att man undersöker proteiner som man vet ungefärligen hur / var de binder i genomet. Vilken metod kan användas om man istället vill ta reda på var ett visst protein binder i genomet?
ChIP-Seq, kromatin immunoprecipitering i kombination med next generation sequencing
Vad är MTERF?
Ett DNA-bindande protein som “försvarar” en 28 bp-region nedströms från 16S rRNA-genen
Vilka är de översiktliga stegen i ChIP-Seq?
- Rena mitokondrier from HeLa cells
- Cross-link mitokondrier
- Lysera and sonikera mitokondriellt DNA till 300bp-fragment
- ChIP - med kontroll-antikropp och specifik antikropp
- “Återvinn” DNA
- Skicka DNA för sekvensering
- Analys av data med hjälp av bioinformatik
