Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

BMA043, Molekylärbiologisk metodik > Metoder att undersöka DNA-protein interaktioner och protein-protein interaktioner > Flashcards

Metoder att undersöka DNA-protein interaktioner och protein-protein interaktioner Flashcards

1
Q

Varför vill man undersöka DNA-protein och protein-protein samband?

A

För att förstå viktiga processer i cellen som exempelvis hur eukaryot DNA replikation eller transkriptionen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vad är mtDNA?

A

Ett litet, cirkulärt, dubbelsträngat DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Hur många proteiner kodar mtDNA för, och vart används dessa?

A

mtDNA kodar för 13 proteiner

Alla dessa ingår i andningskedjan

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Vad kallas de 2 promotorerna för mtDNA?

A

LSP

HSP

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Vilka är de 2 startställena för DNA-replikation av mtDNA?

A

OriH and OriL

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Vilka är proteinerna involverade i mitokondriell replikation, och vad gör respektive protein?

A
  • Twinkle är ett helikas som öppnar upp det dubbelsträngade DNA:t
  • POLGA och POLGB bildar tillsammans ett aktivt DNA-polymeraset som ansvarar för syntes av nya strängar
  • mtSSB binder till det enkelsträngade DNA:t och skyddar det
  • POLRMT lägger ner primers för att DNA-syntesen ska kunna starta och är även involverad i transkription, och syntetiserar nytt RNA
  • TFAM och TFB2M är osäkra, och man vet inte dess exakta funktion
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Vilka metoder kan användas när man vill studera interaktioner mellan “kända” proteiner och DNA?

A
  • Footprinting
  • Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
  • Chromatin immunoprecipitation assays with sequencing (ChIP Seq)
  • Isothermal titration calorimetry (ITC), ny metod
  • Microscale thermophoresis (MST), ny metod
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Vilken metod kan man använda sig av när man vet att ett “okänt” protein binder till ett visst ställe i DNA:t men inte vilket protein det är?

A

DNA-affinitets kolonn

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Vilka metoder kan användas när man vill studera interaktionen av två kända proteiner?

A
  • Gelfiltrering
  • EMSA (om något av proteinerna binder DNA)
  • Immunoprecipitering (IP)
  • Isothermal titration calorimetry (ITC), ny metod
  • Microscale thermophoresis (MST), ny metod
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Vilka metoder kan användas när man letar efter nya interaktionspartners, gällande protein-protein interaktioner?

A
  • Protein affinitetskolonn
  • Immunoprecipitering (IP)
  • BioID, ny metod
  • Jäst-2-hybrid screening, äldre metod
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Vad är fördelen med fraktionering när man vill undersöka funktioner hos proteiner i ett proteinextrakt ur exempelvis vävnad eller celler?

A

Man får en viss “berikning” av proteinerna som man är intresserad av

Om man vill studera ett protein som finns i mitokondrien kan man med hjälp av fraktionering bli av med proteiner som finns i kärnan och cytoplasman, som man ändå inte är intresserad av

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Innan man kör EMSA eller footprinting behöver DNAt inmärkas. Hur går detta oftast till?

A

DNA:t märks oftast in radioaktivt, e.g. med 32P

Då brukar man märka in 5’-änden på DNA:t med hjälp av [y-32P]ATP och T4-polynukleotidkinas

Idag finns även möjlighet att märka in med fluorescens men detta är inte en lika känslig metod som radioaktivitet

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Vad “bygger” EMSA-tekniken på?

A

Att ett komplex mellan DNA och proteiner vandrar långsammare än fritt DNA i en nativ polyakrylamidgelelektrofores

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Vad händer på polyakrylamidgelen vid EMSA?

A

DNA är negativt laddat och vandrar därför efter storlek mot pluspolen i ett elektriskt fält

När proteiner binder till DNA:t blir komplexet större och vandrar därför långsammare

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Vad är uppgiften av POLG?

A

Det ansvarar för syntesen av det mitokondriella genomet i humana celler

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Vad kan EMSA exempelvis användas för?

A
  • Undersöka vilka aminosyror som är nödvändiga i ett protein för att två proteiner ska kunna interagera
  • Med hjälp av EMSA kan man även se att det mitokondriella DNA-polymeraset består av flera subenheter
  • Det finns mitokondriella sjukdomar met mutationer i de olika subenheterna, och med EMSA kan man undersöka om dessa mutationer påverkar interaktionen av de två subenheterna
  • Undersöka om proteiner binder till en viss DNA-sekvens
17
Q

Vad är skillnaden mellan POLGA och POLGB?

A

POLGA = är polymeras- och proofreading-faktor

POLGB = är en processivitetsfaktor

18
Q

Med EMSA kan man undersöka om proteiner binder till en viss DNA-sekvens, men vilken metod används om man vill veta mer exakt var/hur på DNA:t proteinet/proteinerna binder?

A

Footprinting

19
Q

Vilka är stegen som ingår i footprinting-metoden?

A
  1. Precis som i EMSA, så inkuberar man proteinerna med ett radioaktivt DNA-fragment (200-500bp)
  2. DNA klyvs med DNase I. Enzymet kan klyva DNA:t på alla ställen förutom där proteinet sitter bundet
  3. DNase I klyver på olika ställen på olika DNA-molekyler, vilket gör att de blir olika långa
  4. DNA-molekylerna denatureras och de långa fragmenten körs ut på en denaturerande gel ⇒ bildas en “stege”
  5. DNase I kan inte ha klyvt där proteinet suttit, vilket innebär att inga DNA-molekyler av den specifika storleken har bildats ⇒ footprint (ett tomt område på gelen)
20
Q

Vad kan man använda footprinting till? Vad hjälper det oss att förstå?

A

Används för att förstå hur det mitokondriella transkriptionsmaskineriet binder in till promotorn

Man kan bestämma exakt vart proteinerna binder

21
Q

Varför är TFAM (mitochondrial transcription factor A) viktigt?

A

Den fungerar som en rekryterare

TFAM behövs vid promotorn för att rekrytera POLRMT och TFB2M

Om inte den finns så kan inte POLRMT och TFB2M binda till promotorn och initiera transkription

22
Q

EMSA och footprinting bygger främst på att man undersöker proteiner som man vet ungefärligen hur / var de binder i genomet. Vilken metod kan användas om man istället vill ta reda på var ett visst protein binder i genomet?

A

ChIP-Seq, kromatin immunoprecipitering i kombination med next generation sequencing

23
Q

Vad är MTERF?

A

Ett DNA-bindande protein som “försvarar” en 28 bp-region nedströms från 16S rRNA-genen

24
Q

Vilka är de översiktliga stegen i ChIP-Seq?

A
  1. Rena mitokondrier from HeLa cells
  2. Cross-link mitokondrier
  3. Lysera and sonikera mitokondriellt DNA till 300bp-fragment
  4. ChIP - med kontroll-antikropp och specifik antikropp
  5. “Återvinn” DNA
  6. Skicka DNA för sekvensering
  7. Analys av data med hjälp av bioinformatik
25
Q

Vad är funktionen av mTERF1?

A

Det är termineringsfaktor som terminerar transkriptionen från LSP

26
Q

Hur utförs en DNA affinitetsrening?

A
  1. DNA binds upp till en kolonn (oftast med hjälp av biotin) och man försöker sedan hitta proteiner som binder till sekvensen. DNA:t ska vara 30-60bp för att ha den största chansen av att hitta proteinet
  2. Proteiner av intresse binder till kolonnen med det specifika DNA:t (vår konserverade sekvens) men inte till kolonnen med det ospecifika DNA:t
  3. Proteiner som inte binder tvättas bort med en tvättbuffert innehållande relativt låg salthalt (100-200 nM NaCl)
  4. Protein elueras ut från kolonnen med hög salthalt (1 M NaCl), värme eller ändring av pH
  5. Eluerade proteiner analyseras på SDS-gel
  6. De proteiner som verkar vara specifika skickas till MS för identifering
27
Q

Om man har mycket “bakgrund” efter DNA affinitetsrening och analys på SDS-gel, vad kan man ändra för att det ska bli bättre nästa gång?

A
  1. Använda mindre mängd “beads”
  2. Tvätta mer med högre salthalt, vilket minskar den ospecifika inbindningen
28
Q

Om man lyckas identifiera 2 proteiner, men inte är säker på om det är de “rätta”, hur kan det verifieras? Vilka metoder kan användas?

A

Leta efter ytterligare interaktionspartner:

  • Affinitetskolonn men med proteinet som “bete”
  • Immunoprecipitering (IP)
  • BioID
  • Jäst-2-hybridsystemet

Verifiera att ett, två eller flera proteiner interagerar med varandra:

  • Gelfiltrering
  • EMSA (om något av proteinerna binder DNA)
  • Immunoprecipitering (IP)
  • Isothermal titration calorimetry (ITC)
  • Microscale thermophoresis (MST)
29
Q

Förklara kortfattat stegen av immunoprecipitering (IP)?

A
  1. Man har en cellkärna innehållande de två interagerande proteinerna, som man är intresserad av
  2. Nukleär extraktion utförs
  3. Antikroppar riktade mot ett av proteinerna tillsätts
  4. Antikroppsbindande “kulor” adderas
  5. Immunoprecipitering av proteinerna utförs
  6. Immunoprecipiterade proteiner tvättas och samlas
  7. En Western blot analys utförs, där man använder sig av en antikropp riktad mot det andra proteinet
30
Q

Vad är BioID?

A

En ny teknik

Metoden är baserad på närhetsberoende biotinylering av proteiner, vilket utförs av en blandad biotin-ligasmutant BirA (R118G), som är ihopsmält med ditt protein av intresse

BirA biotinylerar proteiner som interagerar med ditt utvalda protein

31
Q

Vad är mitokondriellt helikas?

A

Ett hexameriskt protein som är uppbyggt av 6 subenheter av “samma” protein på 75 kDa var = bildar ett 450 kDa proteinkomplex

32
Q

Varför leder mutationer i linker-regionen i helikaset till mitokondriesjukdom?

A

Vissa mutationer gör att helikaset inte kan bilda sin hexamer-struktur ⇒ ingen helikasfunktion

Den kan därmed inte binda till DNA:t

BMA043, Molekylärbiologisk metodik (8 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions