Genkloning, restriktionsenzymer, plasmider, DNA-elektrofores Flashcards
Vad är transfektion?
Transfektion = när man överför DNA till en human (däggdjurs-) cell
Vad är transformering?
Transformering = när en bakterier tar upp DNA från omgivningen
Hur skiljer sig endo- och exonukleaser åt?
- Endonukleaser är restriktionsenzym som klyver DNA någonstans i mitten av en DNA-sträng
- Exonukleaser är restriktionsenzymer som klyver DNA från ändarna av en DNA-sträng
Vad är en kloningsvektor?
En DNA-molekyl som kan användas för att föra in främmande DNA i en cell
Ett redskap för att föra in DNA i levande celler
Vilka två molekyler är bra att använda som kloningsvektorer?
- Plasmider
- Viruskomponenter
Vad är skillnaden på en icke-integrativ plasmid och en episom? Vilken används mest i genkloning?
I en icke-integrativ plasmid blir plasmiden inte integrerad i bakteriers kromosomer.
I episomer integreras plasmiden i en kromosom. Episomer är därför mer stabila i att ge upphov till specifika genuttryck.
Det finns olika steg i genkloning, vad sker i följande steg?
- Ligering - ihopklistring av DNA-fragment
- Transformering - föra in gen i host
- Selektion - isolering av den plasmid (genuttryck) man vill ha
Vad är en reportergen?
En reportergen är en DNA-sekvens som kodar för ett protein som naturligt inte förekommer i host-organismen
Reportergenen kopplas ofta till en annan gen för att enkelt kunna påvisa denna
Ge några exempel då användandet av reportergener är bra?
- För att kontrollera hur framgångsrikt ett kloningsförsök är
- Man kan sätta in sekvenser framför reportergenen för att undersöka om de fungerar som promotorer och i så fall se hur starka de är
- Man kan använda reportergener för att se hur effektivt kopplade gener translateras eller följa vart genprodukten tar vägen i cellen
Det ställs vissa krav på DNA-molekyler för att de ska vara lämpliga att användas som kloningsvektorer. Vilka är dessa krav?
- Molekylen ska kunna ta sig in i en värdcell
- Molekylen ska ha mutationsförmåga → kunna replikeras inne i cellen för att producera fler kopior av sig själv
- Molekylen ska ha många igenkänningssekvenser för inbindning till → vara polylinker (multiple cloning sites, MCS)
- Molekylen ska ha selektionsmarkörer (reportergener) → typ resistensgener eller gener som kodar för unika protein. (ex GAL-genen: kodar för β-galaktosidas)
Hur fungerar DNA-elektrofores?
DNA rör sig med olika hastighet i en gel under inverkan av ett elektriskt fält
DNA är negativt laddat och separeras utifrån storlek (och hur supercoilat DNAt är, vilken konformationsform)
För genkloning listade Zsolt 3 saker som behövs i sin sammanfattning-slide. Vilka var dessa?
- Värdcell/Selektion system - Oftast en bakterie. Tar upp och underhåller plasmiden (vår kloningsvektor)
- Plasmid DNA - Används för att föra främmande DNA till en levande cell.
- Enzymer - för att klyva nukleotidsekvenser (restriktionsenzymer/nukleaser) och för att klistra ihop nukleotidsekvenser (ligaser)
I sammanfattnings-sliden på genkloningsföreläsningen listade Zsolt 6 punkter i utförandet av en genkloning. Vilka var dessa?
- Skaffa och klyva främmande DNA och plasmid-DNA med motsvarande restriktionsenzym
- Klistra ihop DNA med främmande DNA (ligering) → ger oss rekombinant DNA
- Föra in till värdcell (transformering), oftast bakteria
- Utval av de celler som innehåller klonande, rekombinanta plasmider
- Användning av selektionssystem → vi kan välja ut celler med plasmid
- Användning av reportersystem → vi kan välja ut celler med rätt klon
Vad är klistriga (sticky) och trubbiga (blunt) ändar på en DNA-sekvens?
Det är begrepp som beskriver hur restriktionsenzymer klyver en DNA sträng:
- Blunt = då ett restriktionsenzym klyver en dubbelsträng “rakt av”
- Sticky = då ett restriktionsenzym klyver dubbelsträngen “snett”, alltså översta strängen klyvs på en position mellan två nukleotider och den undre strängen klyvs på en position några nukleotider +/- därifrån den översta klyvdes
Sticky strängar har lättare att binda in till olika saker än vad blunt-strängar har.
