Labhandledning

Question 1

Vad tillför laktamasgenen till sin värdcell?

Answer 1

Ampicillin-resistens

Question 2

Vad är IPTG för något och vad gör den?

Answer 2

IPTG = Isopropyltiogalaktosid

En stark induktor till lac-operonet

Inducerar uttryck av LacZ

Question 3

Vad är X-gal för något, vilket enzym verkar på den och hur, samt vad blir produkten?

Answer 3

X-gal är en färglös galaktosid

Kan hydrolyseras av B-galaktosidas till galaktos och en blåfärgad produkt

Question 4

Vad måste ske för att man ska kunna klona in lambda-DNA i pUC8-plasmiden?

Answer 4

Båda DNA-molekylerna måste först klyvas med samma restriktionsenzym

Sedan ligeras de ihop till olika rekombinanta DNA-molekyler, dvs. pUC8-plasmider med lambda-insert

Question 5

Vad kan E.coli behandlas med för att göra dem kompetenta?

Answer 5

Kalciumklorid

Question 6

Vilket “ämne” imiterar IPTG och vad är X-gal en monolog till?

Answer 6

IPTG imiterar alolaktos

X-gal är en monolog till laktos

Question 7

Hur kan DNA-klyvning kontrolleras, på ett enkelt och smidigt sätt?

Answer 7

Genom elektrofores på minigel

Question 8

Vad är anledningen till att man vill fälla ut DNA med salt och etanol?

Answer 8

För att rena DNA:t från proteiner och andra oönskade komponenter

Question 9

Vid vilken våglängd mäts proteiner respektive DNA spektrofotometriskt?

Answer 9

Proteiner vid 280nm

DNA vid 260nm

Question 10

Efter sekvenseringsreaktioner, hur kan de fluorescens-inmärkta produkterna renas?

Answer 10

Det finns ett flertal metoder - spin-kolonner och fällning med isopropanol eller etanol

Question 11

Vilka är de översiktliga stegen i ultra-sensitive mutation detection?

Answer 11

1. Barcoding PCR
2. Adapter PCR amplification
3. PCR product purification
4. Fragment analyzer analysis
5. Sequencing

Question 12

Vad händer i barcoding PCR-steget i ultra-sensitive mutation detection?

Answer 12

Varje DNA-molekyl barcodas (för att möjliggöra ultra-sensitiv detektion av mutationer)

Dessutom får varje barcodade DNA-molekyl en specifik adaptersekvens på respektive ände

Question 13

Vad händer i “adapter PCR”-steget i ultra-sensitive mutation detection?

Answer 13

Tre olika sekvenser amplifieras med hjälp av en andra uppsättning av adapter primers

Dessa möjliggör den slutgiltliga PCR-produkten att sekvenseras

Dessutom ökar även den totala DNA-koncentrationen i målsekvenserna, vilket också möjliggör sekvensering

Question 14

Vad är transfektion av DNA?

Answer 14

En metod där man på konstlagd väg får celler att ta upp DNA genom sitt plasmamembran, till cytoplasman och vidare till cellkärnan

I cellkärnan kan transfekterat DNA transkriberas till RNA, splitsas (splicing) och polyadenyleras till mRNA som transporteras från cellkärnan ut i cytoplasman till ribosomerna

Ribosomerna kan, vid uttryck av utsöndrade proteiner, vara kopplade till ER för proteinsyntes

Question 15

Vad innebär stabil respektive transient transfektion?

Answer 15

Vid stabil transfektion inkorporeras transfekterat DNA i cellens kromosomala DNA ⇒ detta sker i 1 / 1 000 000 celler och resulterar i en permanent transfektion. Integrerat DNA kommer att replikeras med cellens kromosomala DNA. För att kunna urskilja det transfekterade DNAt från resten måste man använda sig av speciella selektionsmarkörer

Vid transient transfektion integreras inte det transfekterade DNAt i cellens kromosomala DNA, utan kommer istället vara lokaliserat till cellkärnan utan att replikeras. Detta DNA kommer vara kvar endast ett par dagar och sedan försvinna när cellerna delar sig

Question 16

Vilka är de vanligaste teknikerna för att introducera DNA till eukaryota celler?

Answer 16

• Elektroporation
• Kalciumfosfat-transfektion
• Lipid-medierad transfektion
• Polykatjon medierad transfektion (DEAE-dextran transfektion och PEI)

Question 17

Ge exempel på några användningsområden för transfektionsteknikerna?

Question 18

Vart bildas glykohormonet EPO och vad gör den?

Answer 18

Bildas normalt i njurarna

Stimulerar bildningen av erytrocyter i benmärgen

Question 19

Vad innebär reverse transcription?

Answer 19

En process där enkelsträngat RNA transformeras till komplementärt DNA (cDNA) med hjälp av enzymet reverst transkriptas

Question 20

Vilka tre distinkta enzymatiska effekter har reverst transkriptas, som gör det till ett multifunktionellt enzym?

Question 21

Vad är Alu-familjen för något?

Answer 21

En grupp korta repetetiva DNA-element, ca 300 bp långa, som finns spridda i ryggraddjurs genom

I det humana genomet motsvarar de 5% av genomet

Alu-element innehåller ett klyvningsställe för restriktionsenzymet Alu I