Trabajo Práctico nº 9 Flashcards
Membranas internas 1
Compartimentación celular
-Las células eucariotas poseen distintos compartimentos, cada uno está rodeado de una bicapa lipídica que presenta permeabilidad selectiva.
-Núcleo, citoplasma, retículos endoplasmáticos, complejo de Golgi, mitocondrias, peroxisomas y vesículas son ejemplos.
-Núcleo: membrana interna y externa que se continúa con la membrana del RER.
-Citosol: síntesis y degradación de proteínas y donde se degradan la mayoría de las reacciones del metabolismo intermedio.
-RER: surge de una invaginación de la membrana plasmática, su lumen es topológicamente equivalente al exterior celular. Pertenece a los orgánulos de la vía biosintética secretora y endocítica.
Orgánulos de la vía biosintética secretora y endocítica
-Son orgánulos topológicamente equivalentes entre ellos y con el exterior celular, se comunican a través de vesículas.
-Complejo de Golgi
-Lisosomas
-Endosomas
-Vesículas de Secreción
-RER
Principales compartimentos
-Los principales compartimentos se agrupan en 4 familias:
-Núcleo y Citosol: se comunican por los poros nucleares.
-Orgánulos de la vía biosintética secretora y endocítica y peroxisomas
-Mitocondrias
-Cloroplastos (células vegetales)
Señales de Clasificación
-La síntesis de proteínas comienza en los ribosomas libres localizados en el citosol.
-Su destino posterior depende de la presencia o no de diferentes señales de localización.
-La información de a que compartimento pertenece y cual es su destino final se encuentra en la misma proteína.
-Señales de clasificación:
-15 a 60 residuos de Aa.
-Localización: variable:
.Extremo amino terminal (H2N): cuando llega a destino el péptido señal es eliminado por la enzima peptidasa señal.
.Múltiples secuencias alternadas dentro de la cadena polipeptídica (secuencias internas): no se encuentran contiguas, se relacionan cuando la proteína tiene su estructura tridimensional. En las proteínas que se dirigen al núcleo, la secuencia no es eliminada.
.Extremo carboxilo terminal (COOH).
-Tipos de señal:
-CITOSOL: sin secuencia señal.
-NÚCLEO: aa básicos principalmente en regiones internas (Arg y Lys).
-MITOCONDRIA: aa básicos e hidrofóbicos alternados en el extremo amino terminal (NH3).
-RER: aminoácidos hidrofóbicos en el extremo amino terminal. Retención: 4 aa (Lys, Asp, Glu, Leu) en el extremo carboxilo terminal.
-Peroxisoma: 3 aa específicos en el extremo COOH terminal (Ser-Lys-Leu).
Tipos de transporte
-Las proteínas pueden desplazarse entre los compartimentos a través de 3 mecanismos diferentes:
-Transporte Regulado: las proteínas y las moléculas de ARN se desplazan entre el núcleo y el citosol a través de los poros nucleares, los cuales actúan como puertas selectivas.
-Transporte Transmembrana: las proteínas se desplazan desde el citosol hacia otro compartimento topológicamente diferente atravesando la membrana mediante translocadores proteicos. Puede ser hacia mitocondrias, RE, plastos o peroxisomas.
-Transporte Vesicular: las proteínas se desplazan entre compartimentos topológicamente equivalentes a través de vesículas. Orgánulos de la vía biosintética secretora- endocítica (RER, Golgi, endosomas, lisosomas, vesículas de secreción, exterior celular).
Complejo del poro nuclear
-Está formado por 50 o más proteínas llamadas Nucleoporinas: se encuentran repetidas en numerosas copias, cada complejo contienen entre 500 y 1000 proteínas
-Tiene capacidad de transportar hasta 1000 moléculas por segundo.
-Nucleoporinas: de ellas sobresalen fibrillas en la cara citosólica y al interior del núcleo. Hay distintos tipos de nucleoporinas:
-Anulares: anclan el complejo del poro a la envoltura nuclear.
-De Andamiaje: forman anillos externos e internos que deforman la membrana a nivel de los complejos.
-De Canal: delimitan el poro central.
-En el centro del canal presentan regiones no estructuradas, las cadenas polipeptídicas están desordenadas y son ricas en fenil-alanina y glicina: forman una malla hidrofóbica que bloquea la difusión de grandes macromoléculas.
-A nivel de los complejos la membrana se deforma y la membrana nuclear interna y externa son continuas.
Transporte citosol - núcleo
-Es un transporte regulado a través de poros nucleares.
-Las diferentes señales de localización nuclear son reconocidas por distintos receptores de importación nuclear (Importinas).
-Las señales de importación nuclear son ricas en Aa básicos.
-En algunos casos se necesita una proteína adaptadora de importación nuclear, que por un lado se une a la proteína a transportar y por otro lado a una importina.
-Las proteínas unidas a la importina van ingresar por los poros de forma plegada.
-Las señales no se eliminan.
-Proteínas que actúan:
-Importinas: tienen la capacidad de reconocer los aa básicos de las señales nucleares y llevan a la proteína.
-Exportinas: reconocen las proteínas que deben salir del núcleo.
-Proteínas RAN: proteínas tipo G, ayuda en el paso de otras proteínas dentro del núcleo. Con gasto energético de GTP.
Mecanismos de importación y exportación nuclear
-Procesos que generan orden y requieren energía proveniente del GTP unido a la proteína RAN (GTPasa) que se encuentra en 2 estados conformacionales:
-RAN-GTP: núcleo
-RAN-GDP: citosol
-La conversión entre estos 2 estados está regulado por:
-Proteína activadora de la actividad GTPasa (RAN-GAP): convierte el RAN-GTP en RAN-GDP, se encuentra en el citosol.
-Factor intercambiador de nucleótidos de Guanina (RAN-GEF): convierte a RAN-GDP en RAN-GTP, se encuentra en el núcleo.
Importación nuclear
.Proteína con señal de localización nuclear unida a importina
.Atraviesa el poro
.En el núcleo se le une RAN-GTP
.Separación de la proteína de lado nuclear
.Receptor unido a RAN-GTP vuelve al citosol
.En citosol, GAP (RAN-GTP) se transforma en RAN-GDP+Pi: queda libre el receptor para una
nueva proteína.
Exportación nuclear
.RAN-GTP se debe unir al receptor (exportina)
.Induce la unión de la exportina con la proteína que debe exportar
.Todo el complejo atraviesa el poro y se dirige al citosol
.El RAN-GTP se disocia y se transforma en RAN-GDP+Pi
.La proteína se libera del receptor en el citosol
.El receptor vuelve vacío al núcleo
-El ARNm también se une a un receptor de exportación nuclear para salir del núcleo hacia el citosol.
Transporte citosol-membrana
-Es un transporte mediado por proteínas transmembrana.
-Las proteínas atraviesan varias membranas a través de varios translocadores.
-Es un proceso post-traduccional.
Translocación de las proteínas mitocondriales:
-Membrana mitocondrial externa:
-Complejo TOM: necesario para la importación de todas las proteínas mitocondriales. Formado por 2 regiones: un receptor y un canal.
-Complejo SAM: permite la translocación de proteínas en forma de Barril Beta (porinas).
-Membrana mitocondrial interna:
-Complejo TIM 23: transporta proteínas que tienen destino a la matriz mitocondrial y ayuda a la proteína a insertarse en la MMI.
-Complejo TIM 22: permite la inserción de la proteína en la MMI.
-Complejo Oxa: realiza la inserción de la proteína en la MMI (que provenga de ribosomas citosólicos).
-Las proteínas deben atravesar la membrana desplegadas: debido a su interacción con chaperonas de la familia Hsp70.
-La proteína precursora se une con el receptor de importación.
-Es reconocida por el receptor del complejo TOM y las chaperonas se liberan.
-La proteína se inserta en la membrana por el complejo TOM.
-Atraviesa la MME y es translocada a la matriz por el complejo TIM 23
-La secuencia señal es cortada por la peptidasa señal y la proteína se pliega.
-Necesita de energía de la hidrólisis de ATP y del potencial de membrana:
1. Liberación de chaperonas (hidrólisis de ATP).
2. La proteína al translocarse por el complejo TIM (potencial de membrana).
-Hsp70 mitocondriales (chaperonas) forman un complejo ATPasa: importados se unen a las regiones de la cadena polipeptídica y arrastra la proteína hacia dentro de la matriz a través del canal de translocación utilizando energía de hidrólisis de ATP.
Translocación de las proteínas Barril β
-Se unen al complejo TOM
-Son translocados al espacio intermembrana
-Se unen a chaperonas
-Se unen al complejo SAM
-Se insertan en la MME, se pliegan correctamente.
Translocación de proteínas de la MMI
-Se unen al Complejo TOM (MME)
-Son translocadas al Complejo TIM 23 (MMI)
-La secuencia señal es cortada en la matriz mitocondrial (rica en aa hidrofóbicos)
-Se transloca por el Complejo TOM
-La proteína queda anclada a la MMI por una secuencia de paro de translocación.
-En otros casos luego del Complejo TIM 23 se corta la secuencia señal y aparece una 2da secuencia rica en aa hidrofóbicos: es reconocida por el complejo OXA que la ancla a la MMI.
Translocación de proteínas residentes en el espacio intermembrana
-Proteínas ancladas en la MMI pierden la secuencia señal y son liberadas en el espacio intermembrana.
-Proteínas en el espacio intermembrana son ricas en aa cisteína: poseen grupos sulfhidrilos que cuando atraviesan el complejo TOM forman puentes disulfuro: quedan solubles.
Translocación de las proteínas de la MMI multipaso
-La proteína presenta una secuencia señal interna que no se elimina.
-Es reconocida por el complejo TOM
-En el espacio intermembrana se une a chaperonas.
-Las chaperonas la guían al complejo TIM 22: la inserta en la MMI.
Transporte citosol-peroxisoma
-Mecanismo post-traduccional.
-Primero se sintetiza la proteína completa en el citosol y luego ingresa plegada al peroxisoma.
-Metabolismo oxidativo: los peroxisomas poseen enzimas oxidasas que catalizan reacciones oxidativas que generan como producto final peróxido de hidrógeno (H2O2): utilizado por la Catalasa para oxidar otros sustratos mediante reacciones de peroxidación. Puede convertirlo en H2O+O2.
-Función peroxisoma:
.Detoxificación de compuestos hidrosolubles mediante reacciones de oxidación y peroxidación (fenoles, ácido fórmico, formaldehído, alcohol, etc.).
.Acortamiento de ácidos grasos de cadena muy larga (beta oxidación) generando Acetil-CoA que se exporta al citosol.
.Biosíntesis de ácidos biliares y plasmalógenos (fosfolípido más abundante de la vaina de mielina). Relación con enfermedades neurológicas.
-Translocación de las proteínas peroxisomales:
.Secuencia de importación: Ser-Lys-Leu (C-terminal).
.Reconocida por la peroxina 5
.Lleva a la proteína hasta la membrana del peroxisoma.
.La membrana presenta un translocador formado por diferentes peroxinas (forman un poro que adopta sus dimensiones al tamaño de la proteína).
.La proteína puede ingresar plegada al peroxisoma junto con la peroxina 5.
.La peroxina 5 vuelve al citosol vacía para unirse a una nueva proteína.
Transporte citosol-RER
-Mecanismo post-traduccional.
-Transporte transmembrana.
-A medida que se sintetiza la proteína, se transloca en el RER: translocación cotraduccional.
-Secuencia señal amino terminal.
-Sintetizada la secuencia señal, es reconocida por la SRP.
-SRP: partícula de reconocimiento de señal:
.Tiene forma de varilla
.6 cadenas polipeptídicas unidas a una molécula de ARN.
.En uno de sus extremos presenta una región rica en el aa Metionina que forma un bolsillo de unión de la secuencia señal.
.En el otro extremo posee un dominio de pausa de la traducción: se une al ribosoma bloqueando el sitio de unión del factor de elongación y deteniendo la síntesis proteica.
-La secuencia señal se une a la SRP: sufre un cambio conformacional que le permite doblarse y se une (forma de bisagra) al ribosoma bloqueando el sitio de unión del factor de elongación.
-La traducción es pausada de manera transitoria: proporciona el tiempo suficiente al complejo formado para que llegue a la membrana del RER antes que se complete la síntesis de la proteína y no se libere en el citosol.
-Al llegar a la membrana del RER, la SRP se une a su receptor.
-La SRP sufre un cambio conformacional y se libera.
-Se reanuda la síntesis proteica y se transloca al interior del RER a través de un translocador proteico mientras es traducida:
-Forma un canal acuoso por el que pasa la cadena polipeptídica: formado por 3 subunidades proteicas.
-Apertura y cierre del canal está regulado por una corta hélice que mantiene cerrado cuando está inactivo y se desplaza a un lado cuando ocurre la transferencia de una cadena polipeptídica.
-La proteína comienza a translocarse y cuando se transloca lo suficiente la secuencia señal es escindida por la peptidasa señal.
-La proteína queda liberada en el interior del RER.
Mecanismos de proteínas transmembrana unipaso para ingresar al RER
-Proteínas transmembrana unipaso se insertan en la membrana del RER:
-Secuencia de inicio de translocación en el extremo amino terminal.
-Secuencia de paro de translocación (rica en aa hidrofóbicos).
-La proteína se transloca al interior del RER.
-Una peptidasa señal elimina el péptido señal.
-Cuando la secuencia de paro entra en el translocador se frena la translocación
-El translocador se abre lentamente y queda la proteína anclada en la membrana del RER mediante la secuencia de paro.
-Queda el extremo amino en el lado luminal del RER y el extremo COOH en el lado citosólico.
-En otros casos la proteína no presenta la secuencia señal en el extremo amino sino que es interna y también actúa como secuencia de translocación:
-La proteína se sintetiza y cuando aparece su secuencia señal comienza a translocarse
-La proteína se transloca completamente
-No se elimina la secuencia señal
-Cuando el translocador se abre lateralmente, la proteína queda anclada a la membrana del RER.
Inserción de proteínas multipaso en la membrana del RER
-Las proteínas multipaso presentan alternancias de sucesivas secuencias señal y de secuencias de detención que permite anclar varias veces la proteína en la membrana del RER.
-Muchas proteínas del lumen del RER se encuentran en tránsito hacia otros destinos, otras son residentes del RER:
-Contienen en el extremo COOH- terminal una secuencia de 4 Aa (señal de retención en el RER): Lys-Asp-Glu-Leu-COOH-
-Disulfuro Isomerasa: cataliza la oxidación de los grupos -SH de la cadena lateral de las cisteínas para formar enlaces disulfuros -S-S-.
-Proteínas chaperonas: reconocen proteínas plegadas de forma incorrecta.
Modificaciones de las proteínas sintetizadas en el RER
1-N-Glicosilación (agregado y procesamiento de hidratos de carbono).
2-Formación de puentes disulfuro.
3-Plegado apropiado de las cadenas polipeptídicas y ensamblaje de proteínas multiméricas.
4-Cortes proteolíticos específicos.
N-Glicosilación
-Es la adición de un oligosacárido compuesto por 14 residuos de N-acetil glucosamina, manosa y glucosa, al N de la cadena lateral de un residuo de Asparagina.
-Para formar glucoproteínas, luego se encuentran en M.P, Golgi y lisosomas.
-El oligosacárido se sintetiza sobre el dolicol (lípido que se fosforila, en la M del RER) a partir de azúcares previamente activados en el citosol con GDP o UDP. Se unen a través de un enlace fosfato de alta energía.
-Los oligosacáridos añadidos son: 2N-acetil glucosamina, 9 manosas y 3 glucosas.
-Cuando el dolicol está unido a 2N-acetil glucosamina y 2 manosas: SALTO A TRAVÉS DE MEMBRANA: el oligosacárido precursor pasa al interior del RER donde continúa su síntesis hasta los 14 residuos.
-Dentro del RER, el oligosacárido unido al dolicol se transfiere al N de la asparagina por la enzima Oligosacárido Transferasa (asociadas a los translocadores y presentan su sitio activo del lado luminal del RER).
-Procesamiento del oligosacárido: se eliminan 3 glucosas y 1 manosa. El resto se modifica en el Golgi.
Plegado de las cadenas polipeptídicas
-Los oligosacáridos actúan como etiquetas para indicar el estado de plegamiento de las proteínas.
-En el RER, las proteínas se van a plegar, si ocurre de manera incompleta presentan una glucosa terminal que es reconocida por las Calnexinas (chaperona, se encarga de que la proteína se pliegue correctamente).
-Cuando se elimina la Glu terminal por la acción de una Glucosidasa, la proteína se libera de la chaperona.
-Si la proteína se pliega correctamente sale del RER.
-Si la proteína sigue plegada de forma incompleta, es reconocida por la Glucosil transferasa: le agrega una Glu activada previamente con UDP, el oligosacárido vuelve a tener una Glu terminal, vuelve a unirse a la calnexina.
Proteínas mal plegadas
-La acumulación de proteínas mal plegadas causa Estrés del RER que activa diversos mecanismos: evitan el plegamiento anormal de la proteína:
-Inducción de la síntesis de Chaperonas del RER (el splicing pasa a ser realizado en el citosol).
-Freno de los procesos traduccionales.
-Degradación a través del proteosoma en el citosol.
-Apoptosis.
Degradación a través del proteosoma
-Dentro del RER la proteína se une a una chaperona que la mantiene desplegada.
-Atraviesa la membrana del RER a través de un translocador y llega al citosol.
-En el citosol la enzima N-glucanasa elimina los restos del oligosacárido.
-Se adicionan a la proteína pequeñas proteínas llamas ubiquitinas (proceso ubiquitinación) que le indican a la proteína que debe dirigirse al proteosoma para degradarse.
-El proteosoma es un complejo proteico en forma de cilindro que presenta en su interior actividad proteasa.
Cortes proteolíticos específicos
-Algunas proteínas se unen covalentemente a un glucosilfosfatidilinositol: glicolípido que presenta en su extremo un grupo amino perteneciente a una etanolamina.
-Se encuentran ancladas a la membrana del RER por medio de una secuencia de aa hidrofóbicos presentes en su extremo C-terminal.
-El extremo C-terminal se une covalentemente con el grupo amino de la Etanolamina.
-La proteína queda unida covalentemente a la membrana mediante un anclaje GPI.
-Estas proteínas se ubican en la cara externa de la membrana plasmática.
Funciones del REL
1- Síntesis de lípidos (lípidos de membrana, hormonas esteroideas).
2-Detoxificación de drogas o metabolitos liposolubles (familia de Citocromos P450).
3-Secuestro y almacenamiento de Ca++.
Síntesis de fosfatidilcolina REL
-Ocurre en la membrana citosólica del REL, donde se ubican todas las enzimas que participan del proceso.
-La enzima acil-transferasa transfiere los 2 ácidos grasos que estaban unidos a la coenzima A, a una molécula de glicerol: se forma ácido fosfatídico.
-La enzima fosfatasa elimina un grupo fosfato y convierte al ácido fosfatídico en diacilglicerol.
-Se transfiere un grupo polar (CDP-colina) por la colina fosfotransferasa al grupo oxhidrilo expuesto quedando formada la fosfatidilcolina.
-La fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina se forman a partir del diacilglicerol.
-El fosfatidilinositol se forma a partir del ácido fosfatídico.
Detoxificación de sustancias liposolubles
-Por la Citocromo P450: se encuentra anclada en la membrana externa del REL.
-Las reacciones de detoxificación de fármacos a metabolitos tiene la función de que estos compuestos insolubles en agua sean convertidos en compuestos suficientemente hidrosolubles, ej. exponiendo algún grupo hidrofílico, para que puedan ser eliminados a través de la orina.
-Son reacciones de monoxigenación: se utiliza O2 y uno de los átomos de O2 es incorporado al sustrato mientras el otro es reducido a agua, para ello se necesita de los e- que son cedidos por el NADPH que se oxida a NADP.
Almacenamiento de Ca++
-En las células eucariotas, la concentración de Ca++ libre en el citosol es extremadamente baja (10-7M).
-Cualquier entrada de Ca++ se traduce en grandes cambios en su concentración.
-Existen señales que inducen el aumento de Ca++ citosólico: actúa como 2do mensajero.
-El Ca++ se libera del retículo sarcoplasmático hacia el citosol a través de canales de Ca++ (transporte pasivo, difusión facilitada) por un potencial de acción: contracción muscular.
-La relajación de fibras musculares ocurre cuando el Ca++ es secuestrado en el interior del RE sarcoplasmático gracias a la acción de una bomba de Ca++ que transporta Ca++ hacia el interior del RE, necesita energía, a partir de la hidrólisis de ATP.
Diferentes translocadores lipídicos actúa en la biosíntesis de las membranas
-Los fosfolípidos recién sintetizados no pueden translocarse fácilmente a la monocapa interna por sus grupos polares.
-Las flipasas inespecíficas actúan en el RER, se encargan de translocar a la monocapa interna cualquier fosfolípido: equilibra las concentraciones de fosfolípidos de ambas monocapas.
-Cuando los fosfolípidos sintetizados en el RER llegan a la membrana plasmática por medio de vesículas, actúan las flipasas específicas: reconocen aquellos fosfolípidos que contienen grupos NH libres (fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina) y los translocan desde la cara extracelular a la cara citosólica de la M.P.
-En organelas que no forman parte del sistema de endomembranas:
-Los fosfolípidos se importan desde el RER a través de proteínas transportadoras hacia la membrana de la organela, ej. mitocondria.
