Timeline of genome sequencing Flashcards
Noem de volgorde van belangrijke gebeurtenissen:
Darwin en On the origin of the species - Mendel’s wet - DNA isolatie - model voor dubbele DNA helix - DNA-replicatie is semi-conservatief -DNA kloneren in bacteriële plasmiden - Sanger sequencing - PCR - humane genoom compleet - map genetische variatie
Beschrijf kort het proces van Sanger DNA Sequencing:
DNA wordt geamplificeerd via PCR - DNA gedenatureerd - oligonucleotide primer - DNA verdeeld in vier buisjes, toevoeging van NDA polymerase, vier dNTPs en ddNTPs - nieuwe strengen ontstaan - resultaat is vier buisjes met verschillende lengten DNA fragmenten - DNA fluorescent gelabeld en gesequenced a.d.h.v. gel/capillaire elektroforese.
Hoe voorkomen bacteriën dat hun eigen DNA niet door hun eigen restrictie-enzymen wordt geknipt?
Ze modificeren hun restrictiesites (DNA-methylatie).
Waarom is T4 DNA ligase belangrijk en wat doet het?
Het is belangrijk wanneer je een DNA-fragment in een plasmide wilt plaatsen. Het maakt een verbinding tussen de 5’ (plasmide) en 3’ (DNA-fragment), door aan de 3’ 2 van de 3 fosfaatgroepen weg te halen en daar een nieuwe chemische covalente binding te maken.
Wat is een library?
Een verzameling van verschillende klonen
Wanneer spreek je van genome coverage?
Als een geheel genoom wordt gerepresenteerd door een library.
Hoe ontstaat cDNA?
Weefsel lyseren en mRNA zuiveren - mRNA hybdriseert met poly(T)primer die complementair is aan poly-A staart - reverse transcriptase dubbelstreng DNA/RNA laten maken - RNAse H RNA laten afbreken - DNA polymerase vormt dubbelstrengs cDNA
Uit welke stappen bestaat NGS?
Sample preparation - Template amplifaction - Parallel sequencing - Data analysis
Beschrijf de eerste stap van NGS
Het te onderzoeken DNA wordt geisoleerd, gedenatureerd en gefragmenteerd. Er wordt een nucleotide aan de uiteindes gevoegd waar adapters precies op kunnen aansluiten. Het DNA wordt vervolgens geamplificeerd.
Beschrijf de tweede stap van NGS
DNA-library wordt op flowcell geplaatst, ze binden aan de cell via hun adapter die complementair is aan de oligonucleotideprimers die aan de flowcell gebonden zit. Na binding kan DNA-polymerase dubbelstrengs DNA maken. De nieuw gevormde streng wordt weggewassen. Hierna kan de vastzittende streng overbuigen en een brug vormen, hierbij vormt polymerase nogmaals een nieuwe streng, deze blijft vastzitten aan de chip. Dit proces kan herhaald worden.
Beschrijf de derde stap van NGS
Vervolgens worden de strengen die nog vastzitten aan de chip (parallel) gesequenced, de vier fluorescent gelabelde nucleotides worden toegevoegd en bij elke binding wordt de emissiegolf opgevangen door een computer.
Beschrijf de vierde stap van NGS
De nieuwe gesynthetiseerde sequenties worden door de computer geanalyseerd op overlapping en zo kan de sequentie achterhaald worden.
