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Tecnologia de Cultura de Células Animais > Temas 4 e 5 > Flashcards

Temas 4 e 5 Flashcards

1
Q

Laboratório de cultura de células

A

O laboratório deve conter uma parte para a manipulação estéril (cultura de células, área de manipulação estéril, uma área de incubação, uma área de armazenamento), uma parte de serviços de suporte (lavagens, preparação, esterilização)

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2
Q

Área de manipulação estéril

A
  • Câmara de fluxo laminar
  • Zona restrita do laboratório, sem circulação de investigadores
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3
Q

Câmara de fluxo laminar

A

Tudo o que entre ou saia tem de ser borrifado com álcool 70 para desinfetar. Primeira coisa a fazer é limpar a câmara e a nossa superfície de trabalho.
É uma câmara vertical, protege o utilizador e a área de trabalho, o ar entra por baixo da câmara, passa pelos filtros HEPA e desce na vertical um fluxo de ar estéril (vem de cima). O ar que sai para o exterior também passa por um filtro HEPA, protegendo o meio ambiente

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4
Q

Área de incubação

A

Incubadora com a temperatura ideal e com a quantidade de CO2 ideal para manter o pH do meio de cultura e controlo de unidade. Ao pé temos 2 cilindros de CO2 (Risco acrescido para o laboratório têm de estar bem presos)

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5
Q

Área de armazenamento

A
  • bancada de serviço
  • armazenamento de consumíveis
  • perto da área estéril; necessária para contagem de células, microscopia, armazenamento, apoio diverso
    » microscópio invertido: objetivas por baixo da amostra, ou seja, mais próximo das células, isto permite a visualização da placa de células, ou seja, das células aderidas no fundo da placa
    » microscópio invertido de contraste de fase: visualizar em tons de cinzento
    » microscópio fluorescência
    » materiais consumíveis: pipetas, recipientes de cultura, filtros de esterilização, seringas, etc
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6
Q

Serviços de apoio

A
  • preparação: pequeno espaço para preparação de meios de cultura e outras soluções
  • lavagem: fora do lab de cultura de tecidos, devido à humidade e calor produzidos
  • esterilização (a vapor ou a seco)
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7
Q

Preparação e esterilização

A

A contaminação por microrganismos é um problema na cultura de células
- preparação dos reagentes e materiais
- esterilização de instrumentos, materiais e reagentes líquidos

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8
Q

Esterilização a vapor (autoclave)

A
  • alta eficiência
  • líquidos estáveis a altas temperaturas (água, soluções salinas, alguns meios)
  • boa distribuição do calor
    20 min a 121ºC e 100 kPa
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9
Q

Esterilização a calor seco (160ºC, 2h)

A
  • metal
  • vidro
  • alguns plásticos
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10
Q

Materiais termolábeis

A
  • líquidos: filtração
  • sólidos: irradiação gamma ou de outro tipo; etanol 70%
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11
Q

Esterilização de reagentes e do meio

A

Água UltraPura e Água MiliQ
1º nível — água destilada, útil na lavagem de vidro e preparação de reagentes
2º nível — filtração por carbono, remove coloides orgânicos e inorgânicos
3º nível — desionização, remove material inorgânico ionizado
4º nível — filtração por microporos, remove qualquer microrganismo adquiridos a partir do sistema
No fim destes níveis de filtração ficamos com uma água ultrapura — MiliQ usada para a preparação de meios e soluções e reagentes que usamos (água de alta qualidade)

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12
Q

Fluxo laminar e assepsia

A
  • horizontal: protege a área de trabalho
  • vertical: protege o utilizador e a área de trabalho
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13
Q

Objetivos da técnica asséptica

A

Diminuir o risco de contaminação
- Principais contaminantes: bactérias, micoplasma (0,15-0,3 micrómetros), fungos
- Introdução através do operador, atmosfera, superfície de trabalho, soluções e outras fontes
Manter a esterilidade
- Área isolada, acesso restrito, limpeza da superfície de trabalho, higiene pessoal, pipetagem
- Desinfeção, tampas de rosca, chama, manuseamento de garrafas e frascos

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14
Q

Técnica asséptica — Operador

A

Higiene pessoal
- lavar as mãos
- reduzir a conversa
- atar o cabelo
- evitar trabalhar doente
Sossego e concentração

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15
Q

Contaminação de culturas celulares por microrganismos

A

Contaminantes mais frequentes:
- bactérias
- fungos (bolores)
- fungos (leveduras)
- vírus (perigo para o utilizador)
- micoplasma
- protozoários
- insetos
- contaminação por outras células (HeLa são as contaminantes mais frequentes)

Consequências da contaminação:
- depleção de nutrientes
- alteração do pH
- alteração da turbidez do meio
- alteração das características da cultura

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16
Q

Contaminação de culturas celulares por micoplasma

A
  • alterações cromossómicas
  • alteração da expressão génica
  • alterações na antigenicidade da membrana
  • inibição do crescimento celular
  • fragmentação do DNA
  • inibição do metabolismo celular
  • redução da eficiência de transfeção
  • comprometimento da produção de vetores virais
  • morte celular
  • crescimento lento, sem alterações de pH ou turbidez do meio de cultura
  • não detetável por avalização morfológica num microscópio ótico
17
Q

Estratégias para minimizar o risco de contaminação

A
  • verificação visual das culturas regular (olho nu ou microscópio)
  • uso pouco frequente de antibióticos
  • uso de reagentes cell-culture grade: estéreis e sem endotoxinas
  • não partilhar frascos de meio ou reagentes entre utilizadores ou ente diferentes linhas celulares
  • boa observação da técnica asséptica
18
Q

Limpeza e esterilização

A
  • química (70% etanol)
  • radiação ultravioleta
  • calor
  • limpar
19
Q

Procedimentos de rotina

A
  1. Ligar a câmara de fluxo laminar e ligar UVs
  2. Limpar a superfície de trabalho.
  3. Vaporizar a superfície com 70% álcool e esfregar/limpar.
  4. Trazer para a área de trabalho apenas os itens necessários para
    determinado procedimento.
  5. Entre procedimentos, remover tudo o que já não será necessário e
    limpar a superfície onde estavam.
  6. Organizar a área de trabalho de forma a ter fácil acesso a todos os
    itens, de forma a ter espaço de trabalho no centro da câmara de
    fluxo

*Não passar com as mãos ou qualquer outro item não estéril (parte de
fora de um frasco) por cima de uma placa com células aberta.
* Trabalhar com boa visibilidade.
* Limpar qualquer gota caída ou líquido derramado com 70% álcool.
* Remover tudo no fim do procedimento e vaporizar a área de trabalho
com 70 % álcool e limpar.
* Assegurar-se que o espaço por baixo da superfície de trabalho é
limpo regularmente, ou pelo menos 1 vez por semana.

20
Q

Culturas e contaminações

A
  • as culturas vindas de outro laboratório têm um risco elevado de estarem contaminadas (na origem ou no transporte)
  • as culturas celulares importadas devem ser sempre colocadas em quarentena
21
Q

Radiação

A
  • ingestão ou contacto de compostos marcados radioactivamente — DNA
  • irradiação por emissores β e γ de alta energia 32^P, 125^I, 131^I — proteção de chumbo
  • irradiação por Raios-X, U.V. — pele e olhos
22
Q

Sistemas de contenção

A

Três níveis de manuseamento e contenção podem ser definidos:
- Proteção mínima — nível 1
» bancada de trabalho normal
- Proteção do utilizador por agentes RG 2-3
» câmara fluxo laminar
» vertical classe — nível II
- Proteção máxima: câmaras de classe III
» agentes biológicos do grupo 4

23
Q

Resíduos resultantes da cultura de células

A

Normas de segurança específicas para a sua eliminação
Inativação de risco biológico
- materiais de risco biológico devem ser primeiro inativados (70% etanol) antes de serem colocados em sacos de autoclave e autoclavados

Tecnologia de Cultura de Células Animais (10 decks)

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