Temas 4 e 5 Flashcards
Laboratório de cultura de células
O laboratório deve conter uma parte para a manipulação estéril (cultura de células, área de manipulação estéril, uma área de incubação, uma área de armazenamento), uma parte de serviços de suporte (lavagens, preparação, esterilização)
Área de manipulação estéril
- Câmara de fluxo laminar
- Zona restrita do laboratório, sem circulação de investigadores
Câmara de fluxo laminar
Tudo o que entre ou saia tem de ser borrifado com álcool 70 para desinfetar. Primeira coisa a fazer é limpar a câmara e a nossa superfície de trabalho.
É uma câmara vertical, protege o utilizador e a área de trabalho, o ar entra por baixo da câmara, passa pelos filtros HEPA e desce na vertical um fluxo de ar estéril (vem de cima). O ar que sai para o exterior também passa por um filtro HEPA, protegendo o meio ambiente
Área de incubação
Incubadora com a temperatura ideal e com a quantidade de CO2 ideal para manter o pH do meio de cultura e controlo de unidade. Ao pé temos 2 cilindros de CO2 (Risco acrescido para o laboratório têm de estar bem presos)
Área de armazenamento
- bancada de serviço
- armazenamento de consumíveis
- perto da área estéril; necessária para contagem de células, microscopia, armazenamento, apoio diverso
» microscópio invertido: objetivas por baixo da amostra, ou seja, mais próximo das células, isto permite a visualização da placa de células, ou seja, das células aderidas no fundo da placa
» microscópio invertido de contraste de fase: visualizar em tons de cinzento
» microscópio fluorescência
» materiais consumíveis: pipetas, recipientes de cultura, filtros de esterilização, seringas, etc
Serviços de apoio
- preparação: pequeno espaço para preparação de meios de cultura e outras soluções
- lavagem: fora do lab de cultura de tecidos, devido à humidade e calor produzidos
- esterilização (a vapor ou a seco)
Preparação e esterilização
A contaminação por microrganismos é um problema na cultura de células
- preparação dos reagentes e materiais
- esterilização de instrumentos, materiais e reagentes líquidos
Esterilização a vapor (autoclave)
- alta eficiência
- líquidos estáveis a altas temperaturas (água, soluções salinas, alguns meios)
- boa distribuição do calor
20 min a 121ºC e 100 kPa
Esterilização a calor seco (160ºC, 2h)
- metal
- vidro
- alguns plásticos
Materiais termolábeis
- líquidos: filtração
- sólidos: irradiação gamma ou de outro tipo; etanol 70%
Esterilização de reagentes e do meio
Água UltraPura e Água MiliQ
1º nível — água destilada, útil na lavagem de vidro e preparação de reagentes
2º nível — filtração por carbono, remove coloides orgânicos e inorgânicos
3º nível — desionização, remove material inorgânico ionizado
4º nível — filtração por microporos, remove qualquer microrganismo adquiridos a partir do sistema
No fim destes níveis de filtração ficamos com uma água ultrapura — MiliQ usada para a preparação de meios e soluções e reagentes que usamos (água de alta qualidade)
Fluxo laminar e assepsia
- horizontal: protege a área de trabalho
- vertical: protege o utilizador e a área de trabalho
Objetivos da técnica asséptica
Diminuir o risco de contaminação
- Principais contaminantes: bactérias, micoplasma (0,15-0,3 micrómetros), fungos
- Introdução através do operador, atmosfera, superfície de trabalho, soluções e outras fontes
Manter a esterilidade
- Área isolada, acesso restrito, limpeza da superfície de trabalho, higiene pessoal, pipetagem
- Desinfeção, tampas de rosca, chama, manuseamento de garrafas e frascos
Técnica asséptica — Operador
Higiene pessoal
- lavar as mãos
- reduzir a conversa
- atar o cabelo
- evitar trabalhar doente
Sossego e concentração
Contaminação de culturas celulares por microrganismos
Contaminantes mais frequentes:
- bactérias
- fungos (bolores)
- fungos (leveduras)
- vírus (perigo para o utilizador)
- micoplasma
- protozoários
- insetos
- contaminação por outras células (HeLa são as contaminantes mais frequentes)
Consequências da contaminação:
- depleção de nutrientes
- alteração do pH
- alteração da turbidez do meio
- alteração das características da cultura
Contaminação de culturas celulares por micoplasma
- alterações cromossómicas
- alteração da expressão génica
- alterações na antigenicidade da membrana
- inibição do crescimento celular
- fragmentação do DNA
- inibição do metabolismo celular
- redução da eficiência de transfeção
- comprometimento da produção de vetores virais
- morte celular
- crescimento lento, sem alterações de pH ou turbidez do meio de cultura
- não detetável por avalização morfológica num microscópio ótico
Estratégias para minimizar o risco de contaminação
- verificação visual das culturas regular (olho nu ou microscópio)
- uso pouco frequente de antibióticos
- uso de reagentes cell-culture grade: estéreis e sem endotoxinas
- não partilhar frascos de meio ou reagentes entre utilizadores ou ente diferentes linhas celulares
- boa observação da técnica asséptica
Limpeza e esterilização
- química (70% etanol)
- radiação ultravioleta
- calor
- limpar
Procedimentos de rotina
- Ligar a câmara de fluxo laminar e ligar UVs
- Limpar a superfície de trabalho.
- Vaporizar a superfície com 70% álcool e esfregar/limpar.
- Trazer para a área de trabalho apenas os itens necessários para
determinado procedimento. - Entre procedimentos, remover tudo o que já não será necessário e
limpar a superfície onde estavam. - Organizar a área de trabalho de forma a ter fácil acesso a todos os
itens, de forma a ter espaço de trabalho no centro da câmara de
fluxo
*Não passar com as mãos ou qualquer outro item não estéril (parte de
fora de um frasco) por cima de uma placa com células aberta.
* Trabalhar com boa visibilidade.
* Limpar qualquer gota caída ou líquido derramado com 70% álcool.
* Remover tudo no fim do procedimento e vaporizar a área de trabalho
com 70 % álcool e limpar.
* Assegurar-se que o espaço por baixo da superfície de trabalho é
limpo regularmente, ou pelo menos 1 vez por semana.
Culturas e contaminações
- as culturas vindas de outro laboratório têm um risco elevado de estarem contaminadas (na origem ou no transporte)
- as culturas celulares importadas devem ser sempre colocadas em quarentena
Radiação
- ingestão ou contacto de compostos marcados radioactivamente — DNA
- irradiação por emissores β e γ de alta energia 32^P, 125^I, 131^I — proteção de chumbo
- irradiação por Raios-X, U.V. — pele e olhos
Sistemas de contenção
Três níveis de manuseamento e contenção podem ser definidos:
- Proteção mínima — nível 1
» bancada de trabalho normal
- Proteção do utilizador por agentes RG 2-3
» câmara fluxo laminar
» vertical classe — nível II
- Proteção máxima: câmaras de classe III
» agentes biológicos do grupo 4
Resíduos resultantes da cultura de células
Normas de segurança específicas para a sua eliminação
Inativação de risco biológico
- materiais de risco biológico devem ser primeiro inativados (70% etanol) antes de serem colocados em sacos de autoclave e autoclavados
