Tema 6

Question 1

Reagentes e Meios — Balaced Salt Solutions (BSS)

Answer 1

• autoclave ‭→ estáveis a altas temperaturas (água, soluções salinas)
• filtração por membrana ‭→ instáveis a altas temperaturas
  BSS tem glicose
  glicose a alta temperatura (autoclave) ‭→ carameliza
  Se a solução de glicose estiver concentrada 100x (200g/L) não sofre caramelização e podemos adicionar a quantidade desejada ao soro

Question 2

Meio

Answer 2

L-Glutamina: produção de proteínas, fonte de energia, metabolismo de ácidos nucleicos

Degradação = produção de amónia
Prejudiciais em algumas linhas celulares

Meios sem L-Glutamina ‭→ adicionada posteriormente de forma asséptica.
Duração 4ºC = 3 semanas

Dipéptidos de Glutamina (Glutamax, Invitrogen) ‭→ > estabilidade; > biodisponibilidade de glutamina

Question 3

Meio em Pó

Answer 3

Mais ou menos bicarbonato e L-Glutamina
Mais baratos

Question 4

Esterilização do meio

Answer 4

1. Autoclave
   - tem glicose? autoclave não
2. Filtração estéril
   - tamanho do poro: 0,1 a 0,2 μm

Question 5

Qualidade do meio

Answer 5

Controlo de qualidade e teste de esterilização — realizar antes de utilizar
Teste de cultura:
- eficiência de plaqueamento
- curva de crescimento
- expressão de determinada função (ex.: diferenciação)
Armazenamento:
- 4ºC 6-9 meses (meio comprado)
- 3 meses (preparado)
Armazenamento após suplementação: 2-3 semanas
- mais glutamina
- mais soro
- mais antibióticos

Question 6

Soro

Answer 6

Preparação
- variações na constituição, gamas de concentração
- dificuldades na esterilização
Armazenamento:
- -20ºC ‭→ 6- 12 meses
- 2-3 semanas a 4ºC, depois de descongelar
- evitar ciclos de congelação e descongelação ‭→ alíquotas

Turbidez — usar filtro de 0,45μm
precipitado (37ºC por longa duração)‭ → confusão com contaminação
Pode ser provocado pela inativação do soro

Question 7

Inativação de soro

Answer 7

Algumas linhas celulares crescem melhor na presença de soro inativado por calor (células estaminais embrionárias, neurónios e células de inseto)
Procedimento:
1. Descongelar;
2. Colocar a garrafa de soro num banho a 56 °C;
3. Misturar o soro por agitação suave. A T ºC do banho vai diminuir.
4. Quando voltar outra vez aos 56°C manter o soro no banho durante
30 minutos. Misturar suavemente a cada 5 minutos (uniforme);
5. Remover o soro do banho, arrefecer rapidamente;
6. Guardar a -20 ºC ou a T ºC mais baixa.