Tema 3 Flashcards
Condições de Cultura
- Reprodução do ambiente natural das células
- Parâmetros a considerar:
» substrato
» nutrientes
» pH
» temperatura
» humidade
» antibióticos
» esterilidade
» osmolaridade
» viscosidade
Substrato
Maior observação visual das culturas (transparentes)
- plástico (poliestireno — PET)
- vidro — borossilicato (ideal devido às características óticas)
- outros plásticos — cloreto de polivinil (PVC),, policarbonato, etileno de politetrafluor (PTFE), teflon
- fibras: nylon, poly-L-lactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) e seda. Biodegradáveis
- metais: aço inoxidável. Não permite microscopia de luz transmitida
- matrizes sintéticas
Revestimento
- condicionamento com soro, outras células, proteínas da ECM
- polímeros (Poli-D/L-lisina)
- nanopartículas
- colagéneo e gelatina
- matrizes ECM ou componentes ECM: Matrigel (BD), Pronectin F (Protein Polymer Technologies), lamini, fibronectin, vitronectin entactin (UBI), heparan sulfate, EHS Natrix (BD Biosciences), ECL (US Biological), and Cell-tak (BD Biosciences)
- ECM: preparada por células que depois são removidas
Matrigel
- cultura de células polarizadas — células epiteliais
- promove a diferenciação vários tipos de células
ex.: hapatócitos, células do músculo liso e neurónios
Feeder cells
- função de produção de fatores de crescimento ou outros fatores (ex.: metabolitos)
- condicionamento do meio de cultura
- superfície do meio de cultura
- inibição do crescimento das feeder cells com Mitomicina C ou radiação UV
- fibroblastos e células mesenquimais são as feeder cells mais usadas
Sistemas de cultura
Fatores de seleção:
- quantidade de células a cultivar
- monocamada ou suspensão
- ventilação
- amostragem e análise
- custo
Distância na microscopia
A distância é importante na microscopia.
A distância de trabalho entre a lente e a lâmina é normalmente pequena, e é inversamente proporcional à magnificação
pH
pH: sobrevivência, aderência, crescimento e função
-pH 7,4 (maioria das células)
- pH 7.4-7.7 (alguns fibroblastos)
- pH 7.0-7.4 (células transformadas
O meio tem cor devido à adição do Phenol Red para ser indicador do pH, ou seja, se o meio ficar amarelo, o meio ficou ácido devido á células terem consumido todos os nutrientes e libertaram os seus metabolitos; se tivermos um vermelho mais para rosa está alcalino, o que pode indicar a presença de bactérias
Fase de gás
Colocamos CO2 que é essencial para mantes o equilíbrio de gás e pH, precisamos de ter um tampão o Bicarbonato de Sódio (ou HEPES, elevada capacidade de tampão) para tamponizar e mantar o pH do meio. A conjugação da concentração de bicarbonato e de CO2 pormove a osmolaridade e pH corretos
Bicarbonato
- baixa capacidade de tampão
- baixa toxicidade
- baixo custo
HEPES
Elevada capacidade de tampão a pH 7.2-7.6 (20 mM)
Oxigénio (21%)
- principal constituinte do meio gasoso
- culturas de órgãos requerem até 95% O2
- Culturas de células tumorais preferem ambiente hipóxico
- a profundidade do meio de cultura pode influenciar a taxa de difusão do O2 para as células → manter 2-5 mm (0,2 a 0,5 ml/cm^2)
Osmolaridade
Importante manter 260-230 mOsm/kg, mas depois da seleção devem ser mantidas 10 mOsm/Kg
Temperatura
- 37ºC (mamíferos)
- 38.5ºC (células de aves)
- 27ºC (insetos)
- 15-26ºC (animais de sangue frio)
Para além, do efeito direto no crescimento, T influencia pH (<temp → >sol. CO2)
Viscosidade
Depende do conteúdo em soro
Relevante para:
- agitação de células em suspensão
- após dissociação celular
Formação de espuma
- desnaturação
- contaminação
- < difusão de gases
Meio de Cultura — Composição base
- sais inorgânicos (NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4)
- hidratos de carbono, vitaminas, aa, fatores de crescimento, hormonas e microelementos
- tampões: bicarbonato (NaHCO3), fosfato (NaH2PO4) e HEPES
- indicador de pH: vermelho de fenol
Meio de cultura — Soluções salinas
Diluição, meio de lavagem ou dissecção
Composição:
- sais inorgânicos
- glicose
- bicarbonato
Períodos de incubação curtos
Meio de cultura — Meio definitivo (meio basal)
- aminoácidos (AA): glutamina; instável em solução — GlutaMAX (alanil-glutamina)
- vitaminas: sobrevivência e razão de crescimento
- sais: Na+, K+, Cl- (regulam o potencial de membrana); Mg2+; Ca2+ (reduzido em culturas em suspensão) — contribuem para a osmolalidade do meio
- glucose: energia
**- suplementos orgânicos: ** proteínas, piruvato e lípidos. Necessários quando a [soro] é reduzida e manutenção da células especializadas mesmo na presença de soro
- hormonas e fatores de crescimento
- antibióticos
Complexidade variável — Minimum Essential Medium (MEM) ao F12
Meios com e sem soro
Função dos antibióticos
- prevenção de contaminação por diferentes microrganismos (bactérias, micoplasma e fungos). É bastante importante na cultura de células
Bactérias: - penicilina (100U/mL)
- estreptomicina (100 microg/ml)
- gentamicina (50 microg/ml)
Fungos e leveduras - Nystatin (50 microg/ml)
- Anfotericina (10 microg/ml)
Uso rotineiro de antibióticos não é recomendado:
1. má prática da aplicação de técnicas assépticas
2. desenvolvimento de resistência a antibióticos
Soro
Os soros mais comuns são os de vitelo, cavalo e humano.
Proteínas: principais constituintes do soro, albumina, fibronectina, α2-macroglobulina
Polipéptidos: PDGF;
Hormonas: GH
Nutrientes: aa, glucose, lípidos, ácido oleico, etanolanina, etc
Minerais: selénio, cobre, zinco, ferro
Inibidores de crescimento, podem ser inativados por aquecimento (30 min, 56ºC)
Meio de cultura — Meios sem soro
- usados para crescer determinados tipos de células
- realizar experiências na ausência de soro (ex.: transfectar)
Vantagens meio sem soro:
- conhecimento completo dos constituintes totais do meio
- não há variações entre lotes diferentes
- facilita a posterior purificação de produtos celulares
4.. performance celular consistente - aumento do crescimento ou produtividade
- melhor controlo sobre as respostas celulares
- melhor deteção dos mediadores celulares
Desvantagens meio sem soro
- seleção de sublinhagens de células, mesmo em linhas
- o grau de pureza da água e reagentes tem de ser mais elevado
- o crescimento é mais lento
- multiplicidade de meios diferentes para diferentes linhas
Suplementação meio sem soro
- Suplementos comerciais
2, fatores de crescimento
Seleção do meio e do soro
- manutenção dos stocks
- testes de lotes novos de soro
» eficiência de clonagem
» curva de crescimento
» manutenção das características da cultura
» esterilidade
