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tecnologia de cultura de células animais > Tema 3 > Flashcards

Tema 3 Flashcards

1
Q

Condições de Cultura

A
  • Reprodução do ambiente natural das células
  • Parâmetros a considerar:
    » substrato
    » nutrientes
    » pH
    » temperatura
    » humidade
    » antibióticos
    » esterilidade
    » osmolaridade
    » viscosidade
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Q

Substrato

A

Maior observação visual das culturas (transparentes)
- plástico (poliestireno — PET)
- vidro — borossilicato (ideal devido às características óticas)
- outros plásticos — cloreto de polivinil (PVC),, policarbonato, etileno de politetrafluor (PTFE), teflon
- fibras: nylon, poly-L-lactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) e seda. Biodegradáveis
- metais: aço inoxidável. Não permite microscopia de luz transmitida
- matrizes sintéticas

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3
Q

Revestimento

A
  • condicionamento com soro, outras células, proteínas da ECM
  • polímeros (Poli-D/L-lisina)
  • nanopartículas
  • colagéneo e gelatina
  • matrizes ECM ou componentes ECM: Matrigel (BD), Pronectin F (Protein Polymer Technologies), lamini, fibronectin, vitronectin entactin (UBI), heparan sulfate, EHS Natrix (BD Biosciences), ECL (US Biological), and Cell-tak (BD Biosciences)
  • ECM: preparada por células que depois são removidas
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4
Q

Matrigel

A
  • cultura de células polarizadas — células epiteliais
  • promove a diferenciação vários tipos de células
    ex.: hapatócitos, células do músculo liso e neurónios
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5
Q

Feeder cells

A
  • função de produção de fatores de crescimento ou outros fatores (ex.: metabolitos)
  • condicionamento do meio de cultura
  • superfície do meio de cultura
  • inibição do crescimento das feeder cells com Mitomicina C ou radiação UV
  • fibroblastos e células mesenquimais são as feeder cells mais usadas
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6
Q

Sistemas de cultura

A

Fatores de seleção:
- quantidade de células a cultivar
- monocamada ou suspensão
- ventilação
- amostragem e análise
- custo

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7
Q

Distância na microscopia

A

A distância é importante na microscopia.
A distância de trabalho entre a lente e a lâmina é normalmente pequena, e é inversamente proporcional à magnificação

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8
Q

pH

A

pH: sobrevivência, aderência, crescimento e função
-pH 7,4 (maioria das células)
- pH 7.4-7.7 (alguns fibroblastos)
- pH 7.0-7.4 (células transformadas
O meio tem cor devido à adição do Phenol Red para ser indicador do pH, ou seja, se o meio ficar amarelo, o meio ficou ácido devido á células terem consumido todos os nutrientes e libertaram os seus metabolitos; se tivermos um vermelho mais para rosa está alcalino, o que pode indicar a presença de bactérias

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9
Q

Fase de gás

A

Colocamos CO2 que é essencial para mantes o equilíbrio de gás e pH, precisamos de ter um tampão o Bicarbonato de Sódio (ou HEPES, elevada capacidade de tampão) para tamponizar e mantar o pH do meio. A conjugação da concentração de bicarbonato e de CO2 pormove a osmolaridade e pH corretos

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10
Q

Bicarbonato

A
  • baixa capacidade de tampão
  • baixa toxicidade
  • baixo custo
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11
Q

HEPES

A

Elevada capacidade de tampão a pH 7.2-7.6 (20 mM)

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12
Q

Oxigénio (21%)

A
  • principal constituinte do meio gasoso
  • culturas de órgãos requerem até 95% O2
  • Culturas de células tumorais preferem ambiente hipóxico
  • a profundidade do meio de cultura pode influenciar a taxa de difusão do O2 para as células ‭→ manter 2-5 mm (0,2 a 0,5 ml/cm^2)
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13
Q

Osmolaridade

A

Importante manter 260-230 mOsm/kg, mas depois da seleção devem ser mantidas 10 mOsm/Kg

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14
Q

Temperatura

A
  • 37ºC (mamíferos)
  • 38.5ºC (células de aves)
  • 27ºC (insetos)
  • 15-26ºC (animais de sangue frio)
    Para além, do efeito direto no crescimento, T influencia pH (<temp ‭→ >sol. CO2)
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15
Q

Viscosidade

A

Depende do conteúdo em soro
Relevante para:
- agitação de células em suspensão
- após dissociação celular

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16
Q

Formação de espuma

A
  • desnaturação
  • contaminação
  • < difusão de gases
17
Q

Meio de Cultura — Composição base

A
  • sais inorgânicos (NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4)
  • hidratos de carbono, vitaminas, aa, fatores de crescimento, hormonas e microelementos
  • tampões: bicarbonato (NaHCO3), fosfato (NaH2PO4) e HEPES
  • indicador de pH: vermelho de fenol
18
Q

Meio de cultura — Soluções salinas

A

Diluição, meio de lavagem ou dissecção
Composição:
- sais inorgânicos
- glicose
- bicarbonato
Períodos de incubação curtos

19
Q

Meio de cultura — Meio definitivo (meio basal)

A

- aminoácidos (AA): glutamina; instável em solução — GlutaMAX (alanil-glutamina)
- vitaminas: sobrevivência e razão de crescimento
- sais: Na+, K+, Cl- (regulam o potencial de membrana); Mg2+; Ca2+ (reduzido em culturas em suspensão) — contribuem para a osmolalidade do meio
- glucose: energia
**- suplementos orgânicos: ** proteínas, piruvato e lípidos. Necessários quando a [soro] é reduzida e manutenção da células especializadas mesmo na presença de soro
- hormonas e fatores de crescimento
- antibióticos

Complexidade variável — Minimum Essential Medium (MEM) ao F12
Meios com e sem soro

20
Q

Função dos antibióticos

A
  • prevenção de contaminação por diferentes microrganismos (bactérias, micoplasma e fungos). É bastante importante na cultura de células
    Bactérias:
  • penicilina (100U/mL)
  • estreptomicina (100 microg/ml)
  • gentamicina (50 microg/ml)
    Fungos e leveduras
  • Nystatin (50 microg/ml)
  • Anfotericina (10 microg/ml)
    Uso rotineiro de antibióticos não é recomendado:
    1. má prática da aplicação de técnicas assépticas
    2. desenvolvimento de resistência a antibióticos
21
Q

Soro

A

Os soros mais comuns são os de vitelo, cavalo e humano.
Proteínas: principais constituintes do soro, albumina, fibronectina, α2-macroglobulina
Polipéptidos: PDGF;
Hormonas: GH
Nutrientes: aa, glucose, lípidos, ácido oleico, etanolanina, etc
Minerais: selénio, cobre, zinco, ferro
Inibidores de crescimento, podem ser inativados por aquecimento (30 min, 56ºC)

22
Q

Meio de cultura — Meios sem soro

A
  • usados para crescer determinados tipos de células
  • realizar experiências na ausência de soro (ex.: transfectar)
23
Q

Vantagens meio sem soro:

A
  1. conhecimento completo dos constituintes totais do meio
  2. não há variações entre lotes diferentes
  3. facilita a posterior purificação de produtos celulares
    4.. performance celular consistente
  4. aumento do crescimento ou produtividade
  5. melhor controlo sobre as respostas celulares
  6. melhor deteção dos mediadores celulares
24
Q

Desvantagens meio sem soro

A
  1. seleção de sublinhagens de células, mesmo em linhas
  2. o grau de pureza da água e reagentes tem de ser mais elevado
  3. o crescimento é mais lento
  4. multiplicidade de meios diferentes para diferentes linhas
25
Q

Suplementação meio sem soro

A
  1. Suplementos comerciais
    2, fatores de crescimento
26
Q

Seleção do meio e do soro

A
  • manutenção dos stocks
  • testes de lotes novos de soro
    » eficiência de clonagem
    » curva de crescimento
    » manutenção das características da cultura
    » esterilidade

tecnologia de cultura de células animais (10 decks)

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