Introdução (resumo)

Question 1

Células

Answer 1

As células são a unidade básica da vida, sendo mais fácil o seu estudo isolado de modo a perceber o seu comportamento

Question 2

O que é uma cultura de células?

Answer 2

Forma de manter as células vivas, in vitro, em condições controladas (metodologia de crescimento e manutenção ex vivo de células em condições controladas

Question 3

Terapia in vivo

Answer 3

Os procedimentos de terapia génica in vivo consistem em transferir o DNA diretamente para as células ou para os tecidos do paciente

Question 4

Terapia ex vivo, in vitro

Answer 4

DNA é transferido para as células isoladas de um organismo, previamente crescidas em laboratório. Estas células isoladas são modificadas e podem ser introduzidas no paciente

Question 5

Porquê utilizar cultura de células’

Answer 5

• Fácil de estudar funções celulares, farmacológicas, tóxicas, imunológicas, genéticas, biomédicas, biotecnológicas
• Produção de proteínas/anticorpos/vírus/vacinas
• Diminui a utilização de modelos animais (diminui os custos e questões éticas)
• Mais fácil de se trabalhar, obter células purificadas e de se reparar dados genéticos

Question 6

Como se faz uma cultura de células?

Answer 6

Retira-se uma amostra de células do tecido pretendido, de seguida individualizamos as células para termos apenas um único tipo de células.
Fracionar o fragmento em condições estéreis, tratar com enzima que quebra ligações entre as células (para ser mais fácil a sua separação), plaqueá-las num meio próprio. Sendo que para cada tipo de células os passos diferem (diferentes células necessitam de coisas diferentes)

Question 7

Culturas Primárias

Answer 7

Células obtidas a partir de tecido (p.e. biópsia) e mantidas em cultura
- Separação das células através de processos mecânicos e enzimáticos
- População heterogénea ou homogénea
- Divisões celulares limitadas (senescência)
- Proliferação lenta ou inexistente

Question 8

Exemplos de culturas primárias

Answer 8

• fibroblastos
• embrionários de rato
• macrófagos
• neurónios
• células da glia
• células da retina
• células endoteliais aórticas do bovino adulto
• células-tronco (steam cells)
• células de cromafins

Question 9

Linhas celulares (Cell lines)

Answer 9

Células imortalizadas que podem ser cultivadas por longos períodos de tempo
- Imortalização: mutação espontânea ou modificação induzida
- Divisões celulares ilimitadas
- Proliferação rápida
- População homogénea

Ex: células HeLa (primeira linha celular humana e a mais usada)

Question 10

Que tipos de cultura de células?

Answer 10

Origem:
- culturas primárias
- linhas celulares
Necessidade de substrato
- aderentes
- em suspensão
Organização 2D/3D
- monocamada
- várias camadas

Question 11

Formatos de culturas de células — Células de órgãos

Answer 11

A cultura de órgãos implica que a estrutura histológica do tecido seja mantida. O tecido será cultivado na interface líquido - gás favorecendo a retenção de uma forma esférica ou 3D

Question 12

Formatos de culturas de células — Cultura explante (tecido)

Answer 12

Na cultura primária de explantes, um fragmento de tecido é colocado numa interface líquido - sólido, onde as células migram para o meio de cultura na superfície

Question 13

Formatos de culturas de células — Cultura de células

Answer 13

O tecido tem de ser disperso numa suspensão celular que pode então ser cultivada como uma monocamada aderente a um substrato sólido ou como uma suspensão num meio de cultura

Question 14

Formatos de culturas de células — Cultura de células dissociada

Answer 14

Cultivadas numa garrafa, desagrega os tecidos,. separando as células de interesse e as células formam uma monocamada na interface sólido-líquido

Question 15

Formatos de culturas de células — Cultura de células organotípica

Answer 15

Placa especial como membranas, um determinado tipo de célula associa-se e prolifera aderindo à placa, depois é adicionado outro tipo de célula. Co-cultura de diferentes células com ou sem matriz. Reconstrução de um órgão, recriação da sua estrutura. Sem precisar de usar animais

Question 16

Formatos de culturas de células — Culturas tridimensionais (Cultura 3D embebida)

Answer 16

Células podem ser incorporadas em géis de ECM, embebidas numa matriz e formam os organóides

Question 17

Formatos de culturas de células — Culturas tridimensionais (Cultura suporte mecânico)

Answer 17

Células, fatias de órgãos ou órgãos inteiros são cultivados, os tecidos epiteliais podem ser construídos em etapas. Montagem inicial de queratinócitos numa cultura submersa e de seguida a exposição dessas células a uma interface líquido-ar induzindo a formação de epiderme estratificada. Ficamos com um organ explant com uma parte em contacto com o meio de cultura e outra parte ao ar

Question 18

Cultura de Órgãos — Vantagens e Desvantagens

Answer 18

Vantagens:
- preserva a interação celular
- A diferenciação histológica e bioquímica é mantida
Desvantagens:
- Não se pode propagar/subcultivar
- Grande variação entre as réplicas
- Dificuldade na determinação quantitativa devido às variações dna geometria e constituição

Question 19

Cultura de Células — Vantagens e Desvantagens

Answer 19

Vantagens:
- Propagação e divisão em réplicas idênticas
- Preservação por congelação
- Purificação por crescimento em meio seletivo
Desvantagens:
- Falta de organização estrutural
- Perda de arquitetura e propriedades bioquímicas associadas

Question 20

Processo de produção de anticorpos monoclonais

Answer 20

1. Imunização — um rato é imunizado para gerar células B
2. Isolamento de B-cells — as células B são isoladas
3. Fusão com mieloma — as células B são fundidas com células de mieloma, criando hibridomas
4. Seleção em meio HAT — hibridomas são selecionados
5. Triagem para anticorpos desejados — identificação dos hibridomas que produzem o anticorpo desejado
6. Expansão e colheita de anticorpos monoclonais

Question 21

Processo de produção de proteínas recombinantes

Answer 21

1. Linha celular — começa com uma linha celular
2. Vetor de expressão — introdução do gene alvo em um vetor de expressão
3. Transfeção — transferência do vetor para a célula
4. Seleção — seleção das células que expressam a proteína desejada
5. Clonagem de células individuais — isolamento de células produtoras
6. Banco de células — armazenamento das células produtoras
7. Avaliação de crescimento e otimização do processo — avaliação do crescimento e otimização das condições
8. Expansão de clones selecionados — ampliação das células produtoras

Células CHO e HEK293 são as principais na produção de proteínas recombinantes em células de mamíferos