Tema 7 Flashcards
1
Q
Dissociação de Tecidos e cultura primária
A
- O início de uma cultura de células primária
- Isolamento do tecido
- Tipos de Cultura primária
2
Q
O início de uma cultura de células primária
A
- Obtenção da amostra
- Isolamento do tecido
- Dissecação e/ou dissociação
- Cultura no recipiente adequado após implementação da cultura
3
Q
Isolamento
A
- Migração celular a partir de fragmentos de tecido aderido ao substrato
- Dissociação mecânica ou enzimática do tecido → suspensão celular → aderência ao substrato
4
Q
Células aderentes
A
A adesão a uma superfície de crescimento é essencial para a máxima sobrevivência e proliferação (algumas exceções)
5
Q
Sacrifício e dissecação de animais
A
- fora do laboratório de cultura de células/tecidos
- transporte de tecidos a 4ºC
6
Q
Embrião do ratinho
A
tempo de gestação 19-21 dias
13-14 dias = dissecação de órgão individuais
A maioria dos órgãos está completamente desenvolvido ao dia 18 de gestação
7
Q
Embrião de galinha
A
- Facilidade de dissecação — maior tamanho das estruturas para o mesmo estadio de desenvolvimento
- Culturas de tipos celulares específicos (células do olho, hepatócitos, músculo cardíaco)
8
Q
Material de Biópsia Humano
A
- Autorizações adequadas
- Diagnóstico → 1º patologia
- Sistema de coleta bem organizado
- Verificação de infeções (hepatite, HIV, tuberculose)
9
Q
Explantes primários
A
Útil na utilização de pequenas quantidades de tecidos em que há risco de perder as células durante a dissociação mecânica ou enzimática
Desvantagem:
- pouca aderência de alguns tecidos
- técnica de explantes seleciona as células com base na sua migração
Substratos de crescimento:
- Poli-lisina
- Fibronectina
- ECM ou proteínas da ECM
- Feeder layers
10
Q
Dissociação do Tecido
A
- 1ª etapa da cultura primária
- dissociação mecânica e/ou enzimática
- adequada ao tipo celular
- seleção das células com base na resistência ao stress mecânico e proteases
11
Q
Notas sobre o isolamento de um tecido
A
- Gordura e tecidos necróticos - remover durante a dissecção;
- O tecido deve ser cortado com lâminas em bom estado e não
rasgado, para causar o mínimo de dano possível; - As enzimas usadas para a dissociação deverão ser removidas por
centrifugação; - A concentração de células numa cultura de células primária deve
ser muito superior do que as utilizadas na subcultura. Menor
sobrevivência. - Meios mais enriquecidos são preferíveis (Ham’s F12 vs MEM);
- Boa sobrevivência com soro fetal de bovino.
Isolamento de tipos celulares específicos -> meio sem soro; - (6) Tecido embrionário tem melhor dissociação, > nº de células
viáveis e prolifera mais rápido em cultura primária do que tecido
adulto.
12
Q
Dissociação enzimática
A
Enzimas: Tripsina, Colagenase, DNAse
Interações célula-célula: cededrinas (dependentes de cálcio) — usar EDTA e EGTA
mais comum: tripsina ± EDTA, e adicionar ou substituir com outras proteases para melhorar a dissociação caso necessário
Paragem da reação enzimática: diluição, lavagem com centrifugação, soro ou inibidores
13
Q
Aumento da dificuldade em obter células viáveis que proliferam com a idade do animal deve-se a…
A
- diferenciação
- aumento do tecido conectivo fibroso
- ECM
- menor número de célula indiferenciadas
14
Q
Tripsina a frio
A
- 4ºC durante 6 a 18 h > penetração da enzima no tecido mas pouca atividade.
- 20-30 min a 37ºC dissociação
15
Q
Dissociação mecânica
A
Quando a digestão enzimática é agressiva para as células
Tecidos moles que respondem bem à desagregação mecânica:
- baço
- rim de embrião
- cérebro adulto e de embrião
- alguns tumores moles humanos e de animais
16
Q
Após dissociação do tecido
A
- células dissociadas: suspensão celular
- Determinar concentração celular
- Plaquear em densidade adequada ao tipo de cultura
- Manter a cultura pelo tempo pretendido
17
Q
Manutenção de culturas e obtenção de linhas celulares
A
Manutenção de rotina
- mudança/renovação do meio: alteração do pH, densidade celular
- observação da morfologia celular
- subcultura (passagem)
Proliferação? → subcultura (cultura secundária
Diferentes tipos celulares → diferentes tempos de mudança de meio → diferentes tempos para subcultura
nem todas as culturas podem ser subcultivadas
18
Q
Critérios para subcultura
A
- Densidade da Cultura: Confluência - não mais de 24 h
- A subcultura em células transformadas deve ser realizada assim que atinge a confluência. - Proliferação mas deterioração posterior.
Ex: Caco-2 subcultura antes da confluência - dificuldade em tripsinizar. - Exaustão do meio -> mudar
- Descida do pH normalmente deve-se a um aumento da densidade -> necessidade de subcultura. - Tempo após a última subcultura. Calendário rigoroso -> comportamento reprodutível
A determinação da correta densidade de plaqueamento e o intervalo de subculturas obtém-se através da realização de uma curva de crescimento
Evitar realizar subcultura na fase Lag.
Deve ser no final da fase de crescimento exponencial e antes da fase de plateau
19
Q
Desenvolvimento de linhas celulares estáveis
A
- Seleção de linhas celulares específicas
- Estabelecimento de linhas celulares imortalizadas
- Contaminações por outros tipos celulares
- Caracterização de linhas celulares
- Criopreservação e armazenamento de linhas celulares
20
Q
Seleção de linhas celulares específicas
A
- clonagem
- condições seletivas-
- separação física
21
Q
Clonagem celular
A
- Necessidade: preservar um tipo celular específico e as suas propriedades especializadas
- Problema:
» condições experimentais → manutenção de propriedades
» sobrecrescimento de células não especializadas - Problema: isolar linhas clonadas que expressam as propriedades corretas
- Eficiência de clonagem:
» elevada em linhas celulares contínuas
» baixa em culturas primárias
22
Q
Condições seletivas
A
Seleção positiva ou negativa
- inibidores seletivos
- manipulação de condições de cultura
- meios sem soro
- inibidores metabólicos
23
Q
Resistência (seleção positiva)
A
células transfetadas são também resistentes a vários fármacos, como neomicina e geneticina
Gene que confere resistência no plasmídeo usado para a transfeção
Seleção das células transfetadas
24
Q
Sensibilidade (seleção negativa)
A
Células transfetadas — maior sensibilidade ao fármaco de seleção, que sendo tóxico para essa subpopulação, desaparece da cultura
25
Inibidores antimitóticos
- Ara-C: elimina células contaminantes em proliferação
- Mitomicina C: impede a proliferação de fibroblastos
26
Interação com o substrato
- Adesão seletiva
» diferentes tipos celulares diferentes afinidades para o substrato a diferentes ratios de aderência
- Destacamento seletivo
» tratamento de uma monocamada com tripsina ou colagenase removerá algumas células mais rapidamente que outras
» ex.: tripsinização suave das células de microglia em cultura mista com astrócitos
27
Culturas de Astrócitos e de Microglia
Astrócitos — grande adesão ao substrato
Microglia — pouca adesão ao substrato
28
Imortalização
Contínua, com tempo de vida indefinido, perdem a inibição por contacto
Usamos células provenientes de um tumor, já com uma capacidade de divisão diferente ou usamos agentes transformadores
29
Alteração genética do DNA
- vírus (Simian virus SV40, papillomavirus)
- oncogenes (*ras, jun, myc, src*)
- telomerase
- radiação
- agentes químicos
Transfeção (lipofeção, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, ...)
Transdução (viral
30
Imortalização induzida pela telomerase
Senescência — encurtamento de telómeros e paragem da divisão celular
Transfeção com o gene da telomerase *htrt* aumenta o tempo de vida da linha celular
31
Caracterização de Linhas Celulares
Necessidade de caracterização
- relacionar o comportamento celular com o tecido ou com a patologia em estudo
- validação de dados obtidos de experiências realizadas com determinado tipo celular
32
Requisitos para caracterização de uma linha celular
(1)Autenticação – confirmação de que não existe contaminação cruzada.
(2)Confirmação da espécie de origem.
(3) Correlação com o tecido de origem: (a) identificação da linhagem à qual as células pertencem; (b) posição das células na linhagem (células estaminais, percursoras ou diferenciadas?)
33
Parâmetros de caracterização
- Identificação da espécie
» análise cromossomal → cariotipagem
» análise de polimorfismos no DNA mitocondrial → DNA *barcoding*
- Marcadores de linhagem ou de tecidos
» antigénios de superfície celular
» proteínas do citoesqueleto
~ Glial fibrillary acidic protein (GFAP), MAP2, tau
» produtos e funções diversas
~ miosina ou tropomiosina → músculo
~ melanina → melanócitos
- Atividade enzimática
- Morfologia celular
» técnica mais simples de identificação celular
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Conteúdo cromossomal
Cariotipagem — identificação da espécie de origem das células
*Banding* — distinção de variações entre linhas celulares
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contaminação por outros tipos celulares
Desenvolvimento de linhas celulares de crescimento rápido = perigo de contaminação de outras linhas
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Causas de contaminação cruzada
- Pipetas
- Partilha de meio
- Partilha de pipetas entre linhas celulares
- Aberturas de frascos de linhas celulares diferentes abertos em simultâneo
- criopreservação (cultura de frasco errado)
- registo insuficiente: erros de identificação
Mais do que 1 linha celular mantida no laboratório — risco aumentado de contaminação
37
Práticas que ajudam a evitar a contaminação cruzada
1. Obtenção de células de um banco de células idóneo
2. Cuidado no manuseamento de frascos de meio de diferentes
linhas celulares usados em simultâneo
3. Manusear linhas celulares de crescimento rápido (HeLa) de
forma individual e depois das outras culturas.
4. Pipetas diferentes para diferentes linhas celulares.
5. Diferentes garrafas de meio/soro/tripsina (ou outros) para
diferentes linhas celulares.
6. Verificação regular das características celulares (morfologia,
análise de DNA, marcadores, etc… )
7. No início de uma linha celular guardar tecido ou DNA do tecido
original para futuras análises de DNA entre a linha celular e a
presumível origem.
38
Criopreservação
Razões para congelar stocks celulares:
1. Alteração genotípica: instabilidade genética.
2. Senescência: extinção da linha celular.
3. Transformação das propriedades de crescimento e aquisição de características malignas.
4. Instabilidade fenotípica: seleção e desdiferenciação.
5. Contaminação por microrganismos e contaminação cruzada.
6. Erros de identificação.
7. Falha nos equipamentos de manutenção (p.e.incubadora).
8. Poupança tempo e material
9. Necessidade de distribuir por outros utilizadores.
39
Congelamento rápido
- cristais de gelo → lipoproteínas → rutura das membranas celulares
- aumento de [sais] no meio extracelular → choque osmótico
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Congelamento lento
permite que o processo de saída da água aconteça de forma lenta e completa → célula desidratada e sem a presença de cristais de gelo
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Congelação e Descongelação ótimas dependem de:
- minimização de formação de cristais de gelo
- redução de deterioração criogénica
1.Congelação lenta: permite a saída de água da célula, sem favorecer a formação de cristais de gelo
2.Crioprotector hidrofílico: capta a água
3.Armazenar as células à menor T ºC possível para minimizar os efeitos de desnaturação de proteínas
4.Descongelação rápida para minimizar o crescimento de cristais de gelo e o aparecimento de gradientes de solutos
5.Maior sobrevivência quando o congelamento é feito com concentração celular elevada
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Glicerol
Validade = 1 ano → tóxico após armazenamento prolongado
- necessário aumentar a concentração de soro na congelação
43
Curva de arrefecimento
- ponto eutético
- T ºC à qual as fases sólidas e líquidas de uma substância estão em equilíbrio
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Recipientes
Criotubos (cryovials)
- plástico ((polipropileno): mais seguras do que o vidro (alguns bancos celulares — mais tempo melhor selagem)
- fecho correto — fecho forte
- não eppendorfs
Δ Nota de Segurança. Utilizadores inexperientes deverão
evitar usar vidro -> risco de explosão -> óculos
Boa identificação: Que se mantém após passar com álcool
Tipo celular
Designação
Data
Iniciais do utilizador
Inventário/registos → Computador
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Cryofreezers
Células congeladas transferidas rapidamente para o *cryofreezer* quando estão a -80ºC
Armazenamento em N2 líquido (-196ºC) ou arcas -150ºC
46
Substituição do stock de cultura
- intervalos regulares para minimizar a derivação genética e variação fenotípica
- após usar uma linha celular durante 2.5 meses descongelar outro vial
- expandir no sentido de substituir os stocks existentes
- eliminar os stock existentes com mais de 3 meses após descongelação
usar o novo stock
47
Bancos celulares
- armazenamento seguro
- distribuição de linhas celulares validadas
- patentes — hibridomas ou linhas celulares modificadas geneticamente
- primeiro stock — banco de células de confiança onde a caracterização e o controlo de qualidade foram realizados
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Determinação da viabilidade celular
- morfologia nuclear
- redução de MTT ou Alamar blue
- retenção/exclusão de corantes
- cell counters
49
Ensaios de viabilidade
Determinação da quantidade de células viáveis após um procedimento:
- desagregação do tecido
- separação celular
- criopreservação
50
Cálculo da viabilidade — Exclusão do corante
Princípio:
- células viáveis são impermeáveis ao *trypan blue*
Procedimento:
~- misturar a suspensão celular com o corante e examinação visualmente as células
Análise:
- calcular a percentagem de células não corantes
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Cálculo da viabilidade — Captação do corante
Procedimento:
- corar a suspensão celular com uma mistura de iodeto de propídeo e diacetil fluoresceína e examinar as células por microscopia ou citometria
Análise:
- cálculo da percentagem de células com fluorescência em verde
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Determinação do crescimento ou viabilidade através da redução do MTT
Procedimento: determinação da quantidade de formazana produzido por espetroscopia após dissolução num solvente adequado → DMSO ou isopropanol
Medição da absorvância a 570 nm
Análise: comparação da absorvância dos grupos experimentais com um grupo controlo
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Técnicas de Transfeção — Aplicações
Transfeção:
- procedimento de introdução de DNA nas células
- alteração do genoma do hospedeiro pela introdução de um gene exógeno
Aplicações:
- testar a função de determinado gene e/ou proteína
- regular a expressão do gene (silenciar ou sobrexpressar) e analisar alterações fenotípicas a nível celular ou do organismo
- produzir um modelo celular *in vitro* para estudar a regulação da expressão de determinado gene de interesse
- identificar fatores que regulam o gene e o local de ligação ao promotor do gene
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Vetores
Moléculas de DNA usadas como veículos de transferência de material genético de uma célula para outra.
O vetor é geralmente:
- plasmídeo
- sequência de oligonucleótidos
- outros: vetores virais
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Características dos vetores
- Replicação
» capacidade de se replicarem independentemente da célula hospedeira
- Identificação
» possuir um marcador que permite ao investigador detetar a sua presença na célula hospedeira –gene identificador (ou repórter, do inglês reporter gene) que codifica para uma proteína de fácil identificação (por exemplo, resistência a um fármaco ou o gene GFP da proteína verde fluorescente ou outra proteína que o organismo não produza).
- Isolamento e manipulação fácil – geralmente dimensão reduzida relativamente aos cromossomas dos seus hospedeiros.
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Alguns vetores
Ori - permite ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA cromossómico;
MCS (multiple cloning site) – local onde se insere o gene de interesse
Genes de resistência a antibióticos (NEO e Amp r) - permitem selectiva.
- Codificam enzimas capazes de neutralizar o antibiótico que seja tóxico para as células não transfectadas.
- As células transfectadas sobrevivem quando cultivadas na presença do antibiótico.
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Transfeção transfente
O DNA é introduzido no núcleo da célula, mas não integra o cromossoma.
A transcrição do gene transfetado pode ser visualizada nas 24–96 horas após a introdução de DNA.
Deteção envolve normalmente um produto do gene repórter.
Gene repórter é um gene capaz de de produzir um produto facilmente detetável em células eucariotas, sendo por isso usado como marcador para determinar a atividade de outro gene
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Transfeção estável
O DNA transfetado é integrado no DNA cromossomal.
A integração do DNA plasmídico no genoma é um evento raro.
Células transfetadas podem ser selecionadas através de um gene de resistência inserido no mesmo vetor que o gene de interesse.
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Métodos de transfeção
Química — reagentes
- lípidos
- fosfato de cálcio
- polímeros catiónicos
Física — Instrumentos
- eletroporação
- microinjeção
Viral — vírus (transdução)
