Tema 7 Flashcards
Dissociação de Tecidos e cultura primária
- O início de uma cultura de células primária
- Isolamento do tecido
- Tipos de Cultura primária
O início de uma cultura de células primária
- Obtenção da amostra
- Isolamento do tecido
- Dissecação e/ou dissociação
- Cultura no recipiente adequado após implementação da cultura
Isolamento
- Migração celular a partir de fragmentos de tecido aderido ao substrato
- Dissociação mecânica ou enzimática do tecido → suspensão celular → aderência ao substrato
Células aderentes
A adesão a uma superfície de crescimento é essencial para a máxima sobrevivência e proliferação (algumas exceções)
Sacrifício e dissecação de animais
- fora do laboratório de cultura de células/tecidos
- transporte de tecidos a 4ºC
Embrião do ratinho
tempo de gestação 19-21 dias
13-14 dias = dissecação de órgão individuais
A maioria dos órgãos está completamente desenvolvido ao dia 18 de gestação
Embrião de galinha
- Facilidade de dissecação — maior tamanho das estruturas para o mesmo estadio de desenvolvimento
- Culturas de tipos celulares específicos (células do olho, hepatócitos, músculo cardíaco)
Material de Biópsia Humano
- Autorizações adequadas
- Diagnóstico → 1º patologia
- Sistema de coleta bem organizado
- Verificação de infeções (hepatite, HIV, tuberculose)
Explantes primários
Útil na utilização de pequenas quantidades de tecidos em que há risco de perder as células durante a dissociação mecânica ou enzimática
Desvantagem:
- pouca aderência de alguns tecidos
- técnica de explantes seleciona as células com base na sua migração
Substratos de crescimento:
- Poli-lisina
- Fibronectina
- ECM ou proteínas da ECM
- Feeder layers
Dissociação do Tecido
- 1ª etapa da cultura primária
- dissociação mecânica e/ou enzimática
- adequada ao tipo celular
- seleção das células com base na resistência ao stress mecânico e proteases
Notas sobre o isolamento de um tecido
- Gordura e tecidos necróticos - remover durante a dissecção;
- O tecido deve ser cortado com lâminas em bom estado e não
rasgado, para causar o mínimo de dano possível; - As enzimas usadas para a dissociação deverão ser removidas por
centrifugação; - A concentração de células numa cultura de células primária deve
ser muito superior do que as utilizadas na subcultura. Menor
sobrevivência. - Meios mais enriquecidos são preferíveis (Ham’s F12 vs MEM);
- Boa sobrevivência com soro fetal de bovino.
Isolamento de tipos celulares específicos -> meio sem soro; - (6) Tecido embrionário tem melhor dissociação, > nº de células
viáveis e prolifera mais rápido em cultura primária do que tecido
adulto.
Dissociação enzimática
Enzimas: Tripsina, Colagenase, DNAse
Interações célula-célula: cededrinas (dependentes de cálcio) — usar EDTA e EGTA
mais comum: tripsina ± EDTA, e adicionar ou substituir com outras proteases para melhorar a dissociação caso necessário
Paragem da reação enzimática: diluição, lavagem com centrifugação, soro ou inibidores
Aumento da dificuldade em obter células viáveis que proliferam com a idade do animal deve-se a…
- diferenciação
- aumento do tecido conectivo fibroso
- ECM
- menor número de célula indiferenciadas
Tripsina a frio
- 4ºC durante 6 a 18 h > penetração da enzima no tecido mas pouca atividade.
- 20-30 min a 37ºC dissociação
Dissociação mecânica
Quando a digestão enzimática é agressiva para as células
Tecidos moles que respondem bem à desagregação mecânica:
- baço
- rim de embrião
- cérebro adulto e de embrião
- alguns tumores moles humanos e de animais
Após dissociação do tecido
- células dissociadas: suspensão celular
- Determinar concentração celular
- Plaquear em densidade adequada ao tipo de cultura
- Manter a cultura pelo tempo pretendido
Manutenção de culturas e obtenção de linhas celulares
Manutenção de rotina
- mudança/renovação do meio: alteração do pH, densidade celular
- observação da morfologia celular
- subcultura (passagem)
Proliferação? → subcultura (cultura secundária
Diferentes tipos celulares → diferentes tempos de mudança de meio → diferentes tempos para subcultura
nem todas as culturas podem ser subcultivadas
Critérios para subcultura
- Densidade da Cultura: Confluência - não mais de 24 h
- A subcultura em células transformadas deve ser realizada assim que atinge a confluência. - Proliferação mas deterioração posterior.
Ex: Caco-2 subcultura antes da confluência - dificuldade em tripsinizar. - Exaustão do meio -> mudar
- Descida do pH normalmente deve-se a um aumento da densidade -> necessidade de subcultura. - Tempo após a última subcultura. Calendário rigoroso -> comportamento reprodutível
A determinação da correta densidade de plaqueamento e o intervalo de subculturas obtém-se através da realização de uma curva de crescimento
Evitar realizar subcultura na fase Lag.
Deve ser no final da fase de crescimento exponencial e antes da fase de plateau
Desenvolvimento de linhas celulares estáveis
- Seleção de linhas celulares específicas
- Estabelecimento de linhas celulares imortalizadas
- Contaminações por outros tipos celulares
- Caracterização de linhas celulares
- Criopreservação e armazenamento de linhas celulares
Seleção de linhas celulares específicas
- clonagem
- condições seletivas-
- separação física
Clonagem celular
- Necessidade: preservar um tipo celular específico e as suas propriedades especializadas
- Problema:
» condições experimentais → manutenção de propriedades
» sobrecrescimento de células não especializadas - Problema: isolar linhas clonadas que expressam as propriedades corretas
- Eficiência de clonagem:
» elevada em linhas celulares contínuas
» baixa em culturas primárias
Condições seletivas
Seleção positiva ou negativa
- inibidores seletivos
- manipulação de condições de cultura
- meios sem soro
- inibidores metabólicos
Resistência (seleção positiva)
células transfetadas são também resistentes a vários fármacos, como neomicina e geneticina
Gene que confere resistência no plasmídeo usado para a transfeção
Seleção das células transfetadas
Sensibilidade (seleção negativa)
Células transfetadas — maior sensibilidade ao fármaco de seleção, que sendo tóxico para essa subpopulação, desaparece da cultura
Inibidores antimitóticos
- Ara-C: elimina células contaminantes em proliferação
- Mitomicina C: impede a proliferação de fibroblastos
Interação com o substrato
- Adesão seletiva
» diferentes tipos celulares diferentes afinidades para o substrato a diferentes ratios de aderência - Destacamento seletivo
» tratamento de uma monocamada com tripsina ou colagenase removerá algumas células mais rapidamente que outras
» ex.: tripsinização suave das células de microglia em cultura mista com astrócitos
Culturas de Astrócitos e de Microglia
Astrócitos — grande adesão ao substrato
Microglia — pouca adesão ao substrato
Imortalização
Contínua, com tempo de vida indefinido, perdem a inibição por contacto
Usamos células provenientes de um tumor, já com uma capacidade de divisão diferente ou usamos agentes transformadores
Alteração genética do DNA
- vírus (Simian virus SV40, papillomavirus)
- oncogenes (ras, jun, myc, src)
- telomerase
- radiação
- agentes químicos
Transfeção (lipofeção, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, …)
Transdução (viral
Imortalização induzida pela telomerase
Senescência — encurtamento de telómeros e paragem da divisão celular
Transfeção com o gene da telomerase htrt aumenta o tempo de vida da linha celular
Caracterização de Linhas Celulares
Necessidade de caracterização
- relacionar o comportamento celular com o tecido ou com a patologia em estudo
- validação de dados obtidos de experiências realizadas com determinado tipo celular
Requisitos para caracterização de uma linha celular
(1)Autenticação – confirmação de que não existe contaminação cruzada.
(2)Confirmação da espécie de origem.
(3) Correlação com o tecido de origem: (a) identificação da linhagem à qual as células pertencem; (b) posição das células na linhagem (células estaminais, percursoras ou diferenciadas?)
Parâmetros de caracterização
- Identificação da espécie
» análise cromossomal → cariotipagem
» análise de polimorfismos no DNA mitocondrial → DNA barcoding
- Marcadores de linhagem ou de tecidos
» antigénios de superfície celular
» proteínas do citoesqueleto
~ Glial fibrillary acidic protein (GFAP), MAP2, tau
» produtos e funções diversas
~ miosina ou tropomiosina → músculo
~ melanina → melanócitos
- Atividade enzimática
- Morfologia celular
» técnica mais simples de identificação celular
Conteúdo cromossomal
Cariotipagem — identificação da espécie de origem das células
Banding — distinção de variações entre linhas celulares
contaminação por outros tipos celulares
Desenvolvimento de linhas celulares de crescimento rápido = perigo de contaminação de outras linhas
Causas de contaminação cruzada
- Pipetas
- Partilha de meio
- Partilha de pipetas entre linhas celulares
- Aberturas de frascos de linhas celulares diferentes abertos em simultâneo
- criopreservação (cultura de frasco errado)
- registo insuficiente: erros de identificação
Mais do que 1 linha celular mantida no laboratório — risco aumentado de contaminação
Práticas que ajudam a evitar a contaminação cruzada
- Obtenção de células de um banco de células idóneo
- Cuidado no manuseamento de frascos de meio de diferentes
linhas celulares usados em simultâneo - Manusear linhas celulares de crescimento rápido (HeLa) de
forma individual e depois das outras culturas. - Pipetas diferentes para diferentes linhas celulares.
- Diferentes garrafas de meio/soro/tripsina (ou outros) para
diferentes linhas celulares. - Verificação regular das características celulares (morfologia,
análise de DNA, marcadores, etc… ) - No início de uma linha celular guardar tecido ou DNA do tecido
original para futuras análises de DNA entre a linha celular e a
presumível origem.
Criopreservação
Razões para congelar stocks celulares:
1. Alteração genotípica: instabilidade genética.
2. Senescência: extinção da linha celular.
3. Transformação das propriedades de crescimento e aquisição de características malignas.
4. Instabilidade fenotípica: seleção e desdiferenciação.
5. Contaminação por microrganismos e contaminação cruzada.
6. Erros de identificação.
7. Falha nos equipamentos de manutenção (p.e.incubadora).
8. Poupança tempo e material
9. Necessidade de distribuir por outros utilizadores.
Congelamento rápido
- cristais de gelo → lipoproteínas → rutura das membranas celulares
- aumento de [sais] no meio extracelular → choque osmótico
Congelamento lento
permite que o processo de saída da água aconteça de forma lenta e completa → célula desidratada e sem a presença de cristais de gelo
Congelação e Descongelação ótimas dependem de:
- minimização de formação de cristais de gelo
- redução de deterioração criogénica
1.Congelação lenta: permite a saída de água da célula, sem favorecer a formação de cristais de gelo
2.Crioprotector hidrofílico: capta a água
3.Armazenar as células à menor T ºC possível para minimizar os efeitos de desnaturação de proteínas
4.Descongelação rápida para minimizar o crescimento de cristais de gelo e o aparecimento de gradientes de solutos
5.Maior sobrevivência quando o congelamento é feito com concentração celular elevada
Glicerol
Validade = 1 ano → tóxico após armazenamento prolongado
- necessário aumentar a concentração de soro na congelação
Curva de arrefecimento
- ponto eutético
- T ºC à qual as fases sólidas e líquidas de uma substância estão em equilíbrio
Recipientes
Criotubos (cryovials)
- plástico ((polipropileno): mais seguras do que o vidro (alguns bancos celulares — mais tempo melhor selagem)
- fecho correto — fecho forte
- não eppendorfs
Δ Nota de Segurança. Utilizadores inexperientes deverão
evitar usar vidro -> risco de explosão -> óculos
Boa identificação: Que se mantém após passar com álcool
Tipo celular
Designação
Data
Iniciais do utilizador
Inventário/registos → Computador
Cryofreezers
Células congeladas transferidas rapidamente para o cryofreezer quando estão a -80ºC
Armazenamento em N2 líquido (-196ºC) ou arcas -150ºC
Substituição do stock de cultura
- intervalos regulares para minimizar a derivação genética e variação fenotípica
- após usar uma linha celular durante 2.5 meses descongelar outro vial
- expandir no sentido de substituir os stocks existentes
- eliminar os stock existentes com mais de 3 meses após descongelação
usar o novo stock
Bancos celulares
- armazenamento seguro
- distribuição de linhas celulares validadas
- patentes — hibridomas ou linhas celulares modificadas geneticamente
- primeiro stock — banco de células de confiança onde a caracterização e o controlo de qualidade foram realizados
Determinação da viabilidade celular
- morfologia nuclear
- redução de MTT ou Alamar blue
- retenção/exclusão de corantes
- cell counters
Ensaios de viabilidade
Determinação da quantidade de células viáveis após um procedimento:
- desagregação do tecido
- separação celular
- criopreservação
Cálculo da viabilidade — Exclusão do corante
Princípio:
- células viáveis são impermeáveis ao trypan blue
Procedimento:
~- misturar a suspensão celular com o corante e examinação visualmente as células
Análise:
- calcular a percentagem de células não corantes
Cálculo da viabilidade — Captação do corante
Procedimento:
- corar a suspensão celular com uma mistura de iodeto de propídeo e diacetil fluoresceína e examinar as células por microscopia ou citometria
Análise:
- cálculo da percentagem de células com fluorescência em verde
Determinação do crescimento ou viabilidade através da redução do MTT
Procedimento: determinação da quantidade de formazana produzido por espetroscopia após dissolução num solvente adequado → DMSO ou isopropanol
Medição da absorvância a 570 nm
Análise: comparação da absorvância dos grupos experimentais com um grupo controlo
Técnicas de Transfeção — Aplicações
Transfeção:
- procedimento de introdução de DNA nas células
- alteração do genoma do hospedeiro pela introdução de um gene exógeno
Aplicações:
- testar a função de determinado gene e/ou proteína
- regular a expressão do gene (silenciar ou sobrexpressar) e analisar alterações fenotípicas a nível celular ou do organismo
- produzir um modelo celular in vitro para estudar a regulação da expressão de determinado gene de interesse
- identificar fatores que regulam o gene e o local de ligação ao promotor do gene
Vetores
Moléculas de DNA usadas como veículos de transferência de material genético de uma célula para outra.
O vetor é geralmente:
- plasmídeo
- sequência de oligonucleótidos
- outros: vetores virais
Características dos vetores
- Replicação
» capacidade de se replicarem independentemente da célula hospedeira - Identificação
» possuir um marcador que permite ao investigador detetar a sua presença na célula hospedeira –gene identificador (ou repórter, do inglês reporter gene) que codifica para uma proteína de fácil identificação (por exemplo, resistência a um fármaco ou o gene GFP da proteína verde fluorescente ou outra proteína que o organismo não produza). - Isolamento e manipulação fácil – geralmente dimensão reduzida relativamente aos cromossomas dos seus hospedeiros.
Alguns vetores
Ori - permite ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA cromossómico;
MCS (multiple cloning site) – local onde se insere o gene de interesse
Genes de resistência a antibióticos (NEO e Amp r) - permitem selectiva.
- Codificam enzimas capazes de neutralizar o antibiótico que seja tóxico para as células não transfectadas.
- As células transfectadas sobrevivem quando cultivadas na presença do antibiótico.
Transfeção transfente
O DNA é introduzido no núcleo da célula, mas não integra o cromossoma.
A transcrição do gene transfetado pode ser visualizada nas 24–96 horas após a introdução de DNA.
Deteção envolve normalmente um produto do gene repórter.
Gene repórter é um gene capaz de de produzir um produto facilmente detetável em células eucariotas, sendo por isso usado como marcador para determinar a atividade de outro gene
Transfeção estável
O DNA transfetado é integrado no DNA cromossomal.
A integração do DNA plasmídico no genoma é um evento raro.
Células transfetadas podem ser selecionadas através de um gene de resistência inserido no mesmo vetor que o gene de interesse.
Métodos de transfeção
Química — reagentes
- lípidos
- fosfato de cálcio
- polímeros catiónicos
Física — Instrumentos
- eletroporação
- microinjeção
Viral — vírus (transdução)
