tehnologija rekombinantne DNA Flashcards
rekombinantna DNA
polinukleotidna kinaza
terminalna transferaza
eksonukleaza III
rekombinantna DNA= združuje genetski material iz več virov
polinukleotidna kinaza= da fosfatno skupino na 5’ konec
terminalna transferaza= dodajanje istovrstnih nukleotidov na 3’ konec DNA
eksonukleaza III= odstranjuje nukleotide z 3’ kona
najenostavnejši plazmidni vektor
kompetentne bakterije
transformacija
najenostavnejši plazmidni vektor= pBR322 (selekcijski marker, mesto začetka replikacije ori, restrikcijska mesta za vstavljanje tuje DNA)
kompetentne bakterije= sposobne sprejeti tujo DNA
transformacija: bakterije + CaCl2
inkubiramo na hladnem, T šok (42C)
ali z elektroporacijo
restrikcijski encimi
iz bakterij, prepoznajo palindromsko zaporednje DNA in ga cepijo
RE I: naključno na 1000bp od zaporedja
RE III: cepi DNA na 25bp oddaljenem mestu od zaporedja
RE II cepi znotraj palindromskega zaporedja (enostavni, ne rabi ATP)
lepljivi konci EcoRI
topi konci EcoRV
rezanje dveh DNA z restriktazo→ navzkrižno kompatibilni fragmenti
oba konca lepljiva oz. en top
sicer se lahko obrne
PCR
verižna reakcija s polimerizacijo
-DNA matrica
-začetni oligonukleotidi (F smerni, P protismerni)
-deoksiribonukleotidi (dNTP)
-ustrezen pufer
-terostabilna DNA polimeraza (Taq)
-Mg 2+ ioni
90C denaturacija
50-60C vezava dveh sintetičnih oligonukleotidov na začetek in konec odseka
72C sinteza nove DNA
30 ciklov, 2 na 30 kopij
določanje nukleotidnega zaporedja
Sangrejeva metoda
temelji na prekinitvi sinteze verige DNA
→ DNA polimeraza potrebuje prime, matrično verigo DNA in dNTP, ki se veže na prosto 3’ OH skupino
namesto DNTP →ddNTP dideoksinukleozid trifosfat, nima proste 3’OH skupine→ prekinitev sinteze
PCR z enim nukleotidom, ddNTP<dNTP
reakcija poteče ločeno za vsak DDNTP
osnovni dNTP radioaktivno označen
različno veliki fragmenti, analiza page
ali avtomatizirano: fluorescenčno označeni ddNTP
projekt človeški genom
-hiararhično hitro sekvenciranje
DNA fragmentirana na 100 000 bp ali manj, fragmenti vstavljeni v YAC, BAC
veliki fragmenti naključno sekvencirani→ fragmenti se morajo prekrivati→ sestavimo zaporedje
prebližno vedeli kam spadajo fragmenti
človeški genom= 3,2 x 10’9 bp = okoli 25 000 genov
razlike med posamezniki okoli 0,1%
cDNA knjižnjice
DNA prepisi celične mRNA (del genoma, ki se v tkivu izraža)
postopek: ekstrahirana mRNA, reverzna transkriptaza →komplementarna cDNA
mRNA na koncu doda poli A rep, po tem jo ločimo od ostalih molekul
hibrid obdelamo v alkalnem + DNA polimeraza + dNTP → stabilna dvovijačna DNA
izražanje rekombinantnih proteinov v E, coli
gen se vstavi med restrikcijska mesta blizu promotorja (P)
promotor dovoljuje transkripcijo, operator regulira prepisovanje
pod kontrolo promotorja bakteriofaga T7
E. coli v svojem genu zapis za T7 RNA polimerazo, ki je pod kontrolo represorja lac → indukcija z IPTG
