Tecnicas Diagnosticas: PCR Flashcards
1
Q
Tecnicas diagnosticas PCR para que sirve?
A
- Virus, bacterias, hongos, parasitos poseen ac nucleicos y distintas estructuras, ADN y ARN
- Bacterias poseen una cromosoma de ADN circular y posee secuencias unicas lo que permite identificarlas
- Virus ISA anemia infecciosa del salmon: tiene segmentos de ADN, en el segmento 5 y 6 son unicos, en general estos segmentos unicos estan asociados a factores de virulencia
2
Q
¿Como acceder a estas secuencias unicas?
A
- Amplificando, a partir de una muestra patologica
- Importante el estudio de los patogenos tanto fenotipicos, genotipicos, factores de virulencia. Esto a partir de la SECUENCIACION de cada patogeno, y luego aplicarlo al diagnostico
- PCR no amplifica el genoma completo, sino que a secuencias únicas
3
Q
Estructura de ADN
A
- Es una molecula quimica, lineal, polimero no ramificado de nucleotidos que se unen formando una hebra simple de ADN que termina siendo 2 hebras, dan origen a los cromosomas y en caso de bacterias al cromosoma simple. Estructuralmente el ADN es el mismo entre el bacteriano, mamiferos y peces, hay diferencias sutiles, al ser lo mismo la reaccion de PCR puede ser aplicada para eucariontes y procariontes
Nucleótidos: subunidad monomérica del DNA
o Un azúcar de 5 carbonos (ribosa o desoxirribosa)
o Una base nitrogenada
o Una o varios grupos fosfatos
✓ Cuando el nucleótido no contiene el grupo fosfato se llama nucleósido
✓ Se estabilizan mediante puentes de hidrogeno definidos por Watson y Crick
✓ Las hebras son antiparalelas y COMPLEMENTARIAS (especificas)- Puentes de hidrogeno que lo mantienen estable, que son difícil de separar
4
Q
Identificación de patógenos bacterianos y virales por PCR y RT-PCR
A
- Importante considerar si el patógeno es importante intracelular o extracelular
- Virus es intracelular, para extraer el DNA o RNA de este virus hay que romper la célula
5
Q
Toma de muestras patológicas
A
- Extraer muestra de animales enfermos, muertos, a veces hay que hacer programas de monitoreo para ver si tiene algún patógeno presente.
- Muestra de tejido donde este mayormente representada el patógeno asociado (aves y peces también) en este caso los animales están muertos.
- En el animal vivo puede ser saliva, mucus, orina, sangre, heces, etc. Depende del patógeno.
6
Q
Transporte de la muestra para PCR
A
Que no se contamine, que conserve sus propiedades (específicamente ácidos nucleicos)
7
Q
¿Que se hace en el laboratorio para PCR?
A
- Hay una serie de kits para extraer el ADN o RNA de: vegetal, sangre, animal, bacterias y levaduras
- se hace un macerado de la muestra, se rompe el tejido y la célula, se libera el ADN Y ARN
- Columnas con resina de union acidos nucleicos atrapa el DNA o RNA, purificado, el resto pasa de largo
- Lisis permite que se desintegre el tejido y quede transparente, translucido
- La sangre es una muestra compleja, tambien las heces
- Tambien puede ser muestra de hueso, de pelo, de suelo, fluidos en general
- Antes con un bisturi disgregaban el tejido, luego solucion del lisis y desoues a un vortex, lisis acelerado por agitacion y por temperatura (60-70°C) dependiendo del tejido y eficiencia de extraccion va a depender el tiempo de incubacion
- Luego de la lisis se coloca en las columnas de resina y se utiliza la centrifuga para que el ADN quede unido a la resina
8
Q
Rx en cadena de la polimerasa PCR
A
- Para saber si efectivamente estan los acidos nucleicos del patogeno en la muestre
- Descrita el 83 por Kary Mullis
- Que es PCR? Metodo enzimatico in vitro que sintetiza DNA o RNA
- Utiliza dos partidores, que son fragmentos de 20 nucleotidos de hebra simple, y que son complementarias a una region especifica con una secuencia unica del ADN que se quiere amplificar de forma exponencial, miles a millones de veces
- DNA sintetizadas por las DNA polimerasas, requiere de un DNA molde o templado y una hebra que permita la sintesis de una nueva hebra a partir de la de molde
9
Q
Pasos fundamentales del PCR
A
- Denaturación del DNA (1 min a 94°C)→ las hebras se separan, no se rompen
- Apareamiento o annealing (45s a 45°C-65°C ponele que 60) → con el partidor (primer). Cuando la hebra se separa se unen los partidores específicos, que se unen a su region complementaria en la hebra simple que se generó a partir del primer paso.
- Extensión o síntesis del DNA → se realiza a la temperatura optima de la DNA polimerasa utilizada (ej. 72°C para taq polimerasa), la cual en esta etapa comienza la síntesis de la hebra complementaria, a partir de la hebra templado que se genero.
- Resultan 2 hebras, 1 ciclo, 2 ciclo 4, 3er ciclo 8 y asi… son 20- 30- 35 ciclos de amplificación exponencial
- Importante destacar que si hacemos una extraccion de ADN de un NL, no se distingue el del bacteriano ni del hospedero, se extrae un ADN total en el que podria estar presente el de la bacteria
10
Q
Pasos fundamentales del PCR
A
- Denaturación del DNA (1 min a 94°C)→ las hebras se separan, no se rompen
- Apareamiento o annealing (45s a 45°C-65°C ponele que 60) → con el partidor (primer). Cuando la hebra se separa se unen los partidores específicos, que se unen a su region complementaria en la hebra simple que se generó a partir del primer paso.
- Extensión o síntesis del DNA → se realiza a la temperatura optima de la DNA polimerasa utilizada (ej. 72°C para taq polimerasa), la cual en esta etapa comienza la síntesis de la hebra complementaria, a partir de la hebra templado que se genero.
- Resultan 2 hebras, 1 ciclo, 2 ciclo 4, 3er ciclo 8 y asi… son 20- 30- 35 ciclos de amplificación exponencial
- Importante destacar que si hacemos una extraccion de ADN de un NL, no se distingue el del bacteriano ni del hospedero, se extrae un ADN total en el que podria estar presente el de la bacteria
- Esto se ve despues por ELECTROFORESIS DE AGAROSA
- Se utilizan DNA polimerasas que lleguen a los 72°C, bacterianas (no de e coli, tiene que ser termoestable) extremofilas que se aislan de aguas termales y es capaz de soportar estas temperaturas
- TAQ: Thermus aquaticus, bacteria extremofila
11
Q
¿Qué componentes requiere la reaccion de PCR?
A
- Se realizan en tubos de PCR que son pequeños y chicos, y los cambios de temperatura tienen que pasarse rapido a los tubitos ?
- DNA polimerasa termoestable
- Primers especificos y complementarias a la region a amplificar, elemento de especificidad de la reaccion, para ello hay que conocer la secuencia unica en los distintos patogenos, generalmente ya descritos, y se manda a sintetizar el partidor
- Nucleotidos
- Buffer
- ADN
- Cloruro de Magnesio (esencial, sin ella no funciona)
- Termocicladores pueden dar diferentes resultados, no son iguales unos con otros
- Prueba altamente sensible
12
Q
Requisitos para validar el primer o partidor
A
- Para ser validados se toman muestras positivas se diluyen y se ve hasta que rango es sensible la tecnica usando estos partidores
- Tecnicas Gold standar que indique las muestras son positivas y probarlo con los partidores y tienen que dar positivas
- Proceso largo, para eso estan laboratorios de referencia diagnostica, y ligados a departamento gubernamental, como el SAG y SERNAPESCA
- 30- 35 ciclos porque luego ya no es tan termoestable con la bacteria
- Influenza: Tiene una nucleocápside hemaglutinina transferasa (HN), secuencias de proteínas van cambiando como el H1N1, para cada secuencia hay que hacer partidores nuevos.
13
Q
¿Que se hace con los virus con RNA?
A
- En el caso del RNA debe ser previamente transformado en un cDNA a través de la reacción de transcripción reversa, si no no hay amplificación *
- Se le hace un RT-PCR,
- Donde ocurre la transcripción reversa, quien hace la transcripción de RNA a DNA? Los retrovirus como el VIH
- Se extrae el RNA el cual igual utiliza un RNA polimerasa y como molecula templado usa RNA y se sentetiza el cDNA
- Se utiliza un partidor especifico para el RNA viral que se quiere amplificar
- Virus ISA, es un RNA viral de hebra simple
- Transcriptasa reversa es la enzima que participa en pasar de RNA a cDNA
- Un cDNA es un DNA originado por la reaccion de Transcripcion reversa de un RNA. C de complementario
14
Q
¿Cómo podemos evaluar (¿detección?) del ADN?
A
Por electroforesis y en gel de agarosa, este gel nos permite
visualizar al DNA producto del PCR principalmente porque se marca el ADN con un fluoroforo que se une al ADN de forma específica, haciendo que tenga esta característica fluorescente.
Se carga el ADN con la mezcla de reacción en el tubo de PCR, esto se coloca en el termociclador y luego terminado el tiempo la muestra se carga en un gel de agarosa. Al gel se le agrega un
compuesto intercalante que fluorece con el ADN, si lo colocamos en un transiluminador de luz ultravioleta el ADN va a fluorecer.
15
Q
TODA REACCION DE PCR DIAGNOSTICA DEBE TENER UN CONTROL POSITIVO
A
- Si estamos detectando Mycobacterium tuberculosis en la reacción positiva agregaremos DNA de la bacteria cultivada lo que dará positivo si o sí.
- El producto del PCR tiene 400 pares de bases (es un ejemplo, ya que este número varía), esto se sabe porque en la corrida electroforética agregamos un estándar de tamaño de DNA
- La migración del ADN depende del tamaño, mientras mas pequeño migra mas y, si es más grande migra menos→
el de 400 pares de base migrará mas que el de 500. - Se ve si es positivo o negativo de acuerdo con la migración que hubo en el control positivo. PCR positivo → migra a la misma altura que el control +.
