PCR y anticuerpos Flashcards
1
Q
PCR en tiempo real
A
- Variante del PCR convencional
- Soluciona falencias que tiene el PCR convencional, principalmente porque el metodo que tiene este ultimo es de baja sensibilidad, si es poca la cantidad se va a tener falsos negativos, ademas de tener una baja resolucion, porque el producto de PCR lo identificamos por la migración que tiene en el gel de agarosa y genera dudas cuando no migran parejo, no se puede automatizar, y no es cuantitativo y se evalúa al final de la reacción
- esta no utiliza la electroforesis, sino que un equipo de termociclador de tiempo real, monitorea la produccion de PCR originado a través de la fluorescencia que emite el producto, se le agrega un FLUOROFORO A EL PCR EN TIEMPO REAL
- El fluoroforo se une de forma especifica al PCR, si la muestra es positiva aumente la fluorescencia, si es negativa no habrá
- vemos curvas de fluorescencia asociada a la amplificacion de cada ciclo (reaccion cinetica) y se hace un analisis computacional en cada ciclo y se puede cuantificar la cantidad inicial de DNA que teniamos
- El equipo es capaz de leer 96 tubos en el convencional 6
2
Q
¿Que es el CT?
A
- Permite saber que muestra tenia mas carga viral, bacteriana, etc, es una semicuantificacion. ESTO A TRAVES DEL ANALISIS DEL VALOR DE CT o ciclo umbral (ciclo de amplificacion donde se comienza a detectar la fluorescencia de una muestra positiva)
- Fluorescencia es tan alta que pasa un umbral de deteccion que lo determina el equipo, y si lo pasa es positivo, y eso va a depender del ciclo, por ejemplo puede sobrepasar el umbral el ciclo 15 (CT 15) y otra muestra en el ciclo 31 (CT 31), eso quiere decir que el de 15 es mas patogeno
- 35 ciclos se hacen, cuando se acerca mucho a estos números el CT, se repite porque se cree que puede ser un artefacto
3
Q
¿Para que podemos utilizar el PCR en tiempo real?
A
✓ La cuantificación de genes
✓ Detección de patógenos
✓ Evaluar la eficacia de los tratamientos con antibióticos y antivirales
✓ Estimación de daño en el DNA
✓ Genotipificación
- Se puede utilizar diferentes tipos de muestras: leche, sangre, heces, etc.
4
Q
VIDEO
Fundamentos de PCR a tiempo real
A
- Cuando se hace la reaccion existe una sonda fluorescente (o fluoroforo) la que monitorea la produccion de la reaccion del producto de PCR, y se une a la region que se esta amplificando, mientras mas se amplifique mas fluoresce si es que es positiva
- Se ve en gel de agarosa y en el video muestra que a veces en el gel de agarosa no se ve positivo cuando si lo es segun el PCR a tiempo real, lo que prueba que el gel de agarosa puede dar falsos negativos
5
Q
¿Como se utilizo el PCR en tiempo real con el COVID-19?
A
- Muestra nasofaringe que se transporta de manera en que se mantenga la viabilidad de la muestra
- Se extrae RNA (agregando la solucion de lisis) que se hace un RT-PCR (transcripción reversa) para pasarlo a cDNA
- Tambien se utiliza las columnas de resina, centrifuga y se pega el RNA a la resina, se le agrega una solucion que los separa y se tiene el RNA puro
- Tambien se le coloca un buffer de elusion y se libera el RNA viral
- La reaccion se agrega a las 96 placas del PCR en tiempo real y se lleva al tempociclador en tiempo real
- Primero es la reaccion de transcriptasa reversa que logra el cDNA, luego denaturacion, alining de los partidores y extension del DNA
- Se utiliza rtidores con su sonda fluorescente (partidor + fluoroforo)
- LO MISMO SE OCUPA EN LA GRIPE AVIAR
- RT-qPCR es lo que se hizo, transcripsion reversa + PCR en tiempo real
6
Q
Componentes de RT-PCR
A
- Transcriptasa reversa
- DNTP?
- Sonda fluorescente en el caso del PCR en tiempo real
- Partidores especificos
7
Q
Tecnicas diagnosticas utilizando anticuerpos
A
- AC generados para identificación de bacterias, virus y hongos
- No son generados por los animales infectados, sino que son especificos para la reaccion
- Reconocen , principalmente proteinas, antigenos y dentro de ellos las epitopes, de esta manera el anticuerpo identifica los antigenos que estan presente en los patogenos?
- por ej en el caso de los virus vamos a tener principalmente proteínas (de la cápside, de la superficie)
- En el caso de las bacterias vamos a tener proteínas propiamente tal pero también otras estructuras como por ej flagelos que también están compuestos de proteína, y otras estructuras que pueden ser reconocidas por anticuerpos específicos para detectar estos patógenos.
- UTILIZAR ANTIGENOS ESPECIFICOS DE VIRUS Y BACTERIAS para generar anticuerpos
8
Q
¿Como hacer los anticuerpos a partir de los antigenos especificos de los patogenos?
A
- Ratones, gallinas, conejos, cobayas
- Considerar BA y las 3 R, supervisado por comite de Bioetica
- Entonces se les inyecta estos antigenos mezclado con adyuvantes? que protege al antigeno y que sea rapidamente reconocido el antigeno y se de la respuesta inmunitaria, a partir de la 3ra inmunizacion se obtiene un nivel alto, y se saca 10-20% del volumen total de sangre
- Anticuerpos policlonales (vienen de hartas celulas B)
- En el caso de las gallinas se obtiene el anticuerpo desde la yema de los huevos, la EGI?
9
Q
Como obtener AC monoclonales
A
- Un solo clon del linfocito B y se unen a un solo epítope
- Se obtienen a través de la inyección del antígeno a un ratón (solamente ratones).
- Extraemos el bazo (el animal se sacrifica) y las células plasmáticas (linfocito B) y las fusionamos a las células B inmortalizadas (derivadas de un mieloma, células de origen tumorales), se va a formar un hibdridoma el cual va a tener dos características: produce el anticuerpo y al mismo tiempo genera una célula hibrida inmortalizada. Se seleccionan celulas hibridas que produce anticuerpos mejores para el epitope del antigeno que se esta buscando.
- La célula B tiene un ciclo de vida y después se muere, pero con esta fusión se mantiene produciendo el anticuerpo por mucho tiempo.
10
Q
ELISA
A
- Tecnica que permite la deteccion de antigenos inmovilizados sobre una placa solida
- puede agregar muestras de sangre, suero, leche
- Antigenos y anticuerpos que estaban en la muestra se van a pegar estos antigenos con su anticuerpo respectivo
ELISA directo e indirecto
ELISA SANDIWCH: Anticuerpo de captura (casi siempre monoclonal o oligoclonal) (primario), se agrega la muestra y si esta presente captura el antigeno en cuestion, se lava y se agrega el segundo anticuerpo que va unido a una enzima para el color?
Ninguna tecnica excluye a la otra, se complementan
