Técnicas de estudios

Question 1

Técnicas de biología celular y molecular

Answer 1

Microscopio que usa luz y su límite de resolución son 200 nanómetros

Question 2

Microscopio electrónico de transmisión MET

Answer 2

Microscopio electrónico de transmisión. Este tipo de microscopio no usa luz, sino que usa electrones. Tiene gran resolución, su límite es de 0,1 nanómetros. Nos permite ver la estructura interna de una célula

Question 3

Microscopia electronica de barrido MEB

Answer 3

Microscopio electrónico de barrido. Este tipo de microscopio nos permite ver estructuras en 3D. En vez de observar cortes, este solo mira la topografía , viendo las características de rugosidades ejemplo

Question 4

Hematoxilina y eosina

Answer 4

Hematoxilina y eosina. Son colorantes que se ocupan para teñir muestras y poder observarlas en el microscopio. La hematoxilina es un colorante básico que tiene afinidad por los ácidos, es por eso que se asocia al núcleo y lo tiñe azul/morado. La eosina en cambio, es un colorante básico que tiene afinidad por el citoplasma tiñéndolo rojo/rosado

Question 5

Inmunohistoquímica

Answer 5

Es dificil visualizar las proteínas en una célula. Esta técnica utiliza un anticuerpo primario contra una proteína específica y se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con una enzima. El anticuerpo secundario reconocerá la parte invariable del anticuerpo, y la gracia es que la enzima cataliza una reacción de oxidación donde el producto es coloreado. Esa coloración permite ver la proteína

Question 6

Inmunofluorescencia

Answer 6

A diferencia de la inmunohistoquimica la cual utiliza dos anticuerpos conjugado con enzimas, la inmunofluorescencia utiliza un solo anticuerpo que esta unido directamente a un fluoroforo, logrando que se vean los lugares con presencia de la proteina estudiada con fluorescencia.

Question 7

Inmunofluorescencia

Answer 7

A diferencia de la inmunohistoquimica la cual utiliza dos anticuerpos conjugado con enzimas, la inmunofluorescencia utiliza un solo anticuerpo que esta unido directamente a un fluoroforo, logrando que se vean los lugares con presencia de la proteina estudiada con fluorescencia.

Question 8

Analisis de acidos nucleicos, sobreexpresión de genes en la celula

Answer 8

1.-Transdución retroviral –> Se usan particulas virales con la secuencia de DNA que queremos sobreexpresar. Cuando infectan la célula el material genético se integra en su genoma y ella y todas las hijas lo sobreexpresan
2.-Transducción adenoviral –> Es con adenovirus así que no hay integración en el genoma por eso despues de ciertas replicaciones se acaba
3.-Transfección –> Con DNA circular, no se usa células virales (no se propaga en el tiempo), la secuencia de DNA que se sobre expresa va dentro de un plasmido (vector) que ingresa a través de poros

Question 9

Silenciamiento de genes

Answer 9

1.-Knockdown –> Se disminuyen los niveles de expresión de una proteína. Se usa una secuencia de RNA que se transfecta y se incorpora. Dentro de la celula se procesa para ser siRNA (RNA de silenciamiento) que es complementario a una región en particular de mRNA que codifica para la proteina que queremos silenciar. Al formarse una doble cadena de RNA es leida por el complejo RISC y es degradada, debido a que el RNA es de cadena simple entonces es anormal, logrando asi que no sea traducido
2.-Knockout –> Se inhibe completamente la expresión de un gen. Se actua a nivel de gen transcrito, donde una tijera molecular corta parte de este gen, inducciendo a una mutación, formando una proteina no funcional.

Question 10

GFP

Answer 10

Proteína fluorescente verde, es un reportero utilizado en estudios de expresión génica en organismos vivos. Sirve para realizar estudios in vivo

Question 11

Electrodensidad

Answer 11

El microscopio electronico de transmisión emite un haz de electrones dirigidos hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesas formando una imagen aumentada de la muestra. En las zonas más densas, los electrones rebotan y por ende la placa de la imagen se ve más negra.

Question 12

Fragmentación celular

Answer 12

Se realiza un homogenizado del tejido, en el cual se rompen las celulas obteniendo su contenido en tubo, donde, a través de un centrifugado, se separan los diferentes componentes según densidad. Utilizando centrifugaciones de diferentes tiempos y fuerzas

Question 13

Electroforesis

Answer 13

Se emplea para separar Proteínas o ácidos nucleicos
Se deposita en matriz porosa (Gel) y se hacen migrar por el campo électrico
–>Proteinas: Poliacrilamida como gel, primero se desanturan con B-
mercaptoetanol logrando asi el desplegamiento a una
estructura primaria, para que su migración tenga que ver solo
con el tamaño y no con las cargas (Al desplegarla, quita los
enlaces de la estructura terciaria que otorga una carga) la mas
grande migran con menor distancia.
–>DNA: Migra hacia el polo positivo (recordar que DNA es negativo) la mas grande migran con menor distancia

Question 14

Western blot

Answer 14

(Similar a la inmunohistoquimica), permite detectar proteinas especificas previamente separas mediante la electroforesis. Las proteinas son transportadas desde la poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Posteriomente se incuba la membrana con un anticuerpo primario y luego con un anticuerpo secundario que reconoce la región constante del anticuerpo primario. Este anticuerpo srcundario va congujado por la enzima peroxidasa, que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente.
Se necesita un marcador de carga b-actina para asegurarse de que cuantifique bien las proteinas.

Question 15

Pasos western blot

Answer 15

Preparación muestra –> Centrifugado
Separación –> Electroforesis
Transferencia –> Desde poliacrilamida a membrana de nitrocelulosa
Inmunotinción –> Parecido a la inmunohistoquimica
Visualización

Question 16

B-actina

Answer 16

Se utiliza como control de carga en el western blot, para verificar que todas las bandas estén igualmente cargadas

Question 17

Southern blot

Answer 17

Similar al western blor pero para la detección de DNA. En esta técnica no se requieren anticuerpos. Lo que se hace es marcar una secuencia nucleotídica o hebra de ácidos nucleicos (sonda), siendo esta hebra complementaria al materia genetico cuya presencia se busca. La esencia de la técnica radica en aprovechar la complementariedad de bases, que es especifica, permitiendo la hibridación de la secuencia que se quiere detectar con la sonda marcada

Question 18

Northern blot

Answer 18

Similar al western blot, pero para detección de RNA. Se usa una electroforesis para la separación de RNA por tamaño; luego se transfiere a una membrana , se incuba con una sonda específica.

Question 19

Test ELISA

Answer 19

Estrategia que se utiliza para cuantificar proteinas de forma cuantitativa. En un pocillo esta el anticuerpo que reconoce el antigeno, despues se conjuga un segundo anticuerpo con una enzima (peroxidasa), la intensidad de color es proporcional a la cantidad de antigeno. Es usada para identificar antigenos o anticuerpos en VIH y hepatitis B

Question 20

PCR

Answer 20

Reacción de polimerasa en cadena. Permite amplificar el DNA
tres etapas:
1.-Desnaturalización –> A altas temperaturas (95 grados), el DNA rompe su doble helice por la ruptura de sus puentes de hidrogeno
2.-Hibridación –> Se baja la temperatura a 55-65 grados, se se unen los partidores especificos (primers) los cuales son secuencias nucleotidicas complementarias a los extremos 5” y 3”
3.-Elongación –> Se debe agregar magnesio porque es un cofactor fundamental para la polimerización de la hebra complementaria, ayudando a la Taq-polimerasa la cual agrega los desoxinucleotidos complementarios

Question 21

Ingredientes PCR

Answer 21

Buffer, Taq-polimerasa, DNA, Primer, Desoxinucleotidos complementarios y Magnesio

Question 22

Taq-Polimerasa

Answer 22

Extraida de una bacteria extremofila (vive en condiciones extremas), tiene la caracteristica de resistir a cambios en la temperatura y condiciones en la que se realiza la reacción. Tiene la tarea de unor los desoxinucleotidos complementarios al DNA desnaturalizado (es equivalente a la enzima en el RT-PCR)

Question 23

Partidores especificos (Primers)

Answer 23

Secuencias nucleotidas que son complementarias a los extremos 5” y 3”
(Son equivalente a OligodT del RT-PCR)

Question 24

Magnesio en PCR

Answer 24

Cofactor de la polimerización

Question 25

RT-PCR

Answer 25

Reacción de polimerasa en cadena con transcriptasa reversa. Permite amplificar DNA a partir de una muestra de RNA

Question 26

Transcriptasa reversa

Answer 26

Enzima que es capas de leer el RNAm y ahora convertirlo en DNA, pero cDNA ya que no incluye los intrones

Question 27

OligodT

Answer 27

Secuencia nucleotídica de timinas que actúa como primer lugar de ensamblaje, ya que, el RNA mensajero posee zonas poly A, que son zonas de muchas adeninas

Question 28

cDNA

Answer 28

DNA complementario, molecula de DNA complementaria a la de RNA, no es idéntico al DNA porque no incluye intrones

Question 29

Housekeeping

Answer 29

Gen de expresión constitutiva. Son genes que se expresan con la misma intensidad en todas las células, por lo que en base a ellos se puede realizar una comparación semicuantitativa de cuanto se expresa un gen

Question 30

Pcr en tiempo real

Answer 30

Tecnica altamente sensible que permite amplificar y cuantificar una secuencia nucleotídica específica, usando:
1.-Fluoróforos (SYBR GREEN) que se unen a la doble hebra y cada vez que se forma una doble hebra fluorece
2.-Sondas especificas marcadas con fluróforos (Taqman) Donde estan los partidores en cada uno de los extremos, se ve un fluróforo y un apagador de fluroforo. Si ambas se encuentran muy cerca entre si, no se verá la emisión del fluroforo pero, si la actividad exonucleasa de la polimerasa es capaz de romper esta sonde mientras va amplificando, el fluroforo se separa del apagador y hay emisión de fluorescencia. Es mas especifico que el Sybergreen por el uso de sonda mas partidoras

Question 31

FISH

Answer 31

Hibridación fluorescente in vitro. Tecnica de laboratorio para detectar y localizar una secuencia especifica de DNA en un cromosoma. La tecnica se basa en exponer los cromosomas a una pequeña secuencia de DNA (sona) que tiene una molécula fluorescente pegada a ella. Esta secuencia de la sonda se una secuencias complementarias, y el fluoróforo permite ver la hibridación. Esto se usa para ver los territorios cromosómicos.

Question 32

Hibridación in situ

Answer 32

Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de una sonda (formada por una secuencia de DNA previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de DNA o RNA complementaria, en la muestra a estudiar. Sirve para localizar subcelularmente DNA, RNA o detectar formas de splicing alternativo. Esta tecnica se fundamenta en la complementariedad de bases.