Technologie de l'ADN (par: Luiz Alberto) Flashcards
C’est quoi les enzymes de restriction?
Ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
La vaste majorité des enzymes de restriction reconnaissent quel genre de séquences?
palindromiques
C’est quoi des séquences palindromiques?
Une séquence palindromique se lit de la
même façon dans le deux directions
L’enzyme de restriction coupent quel liens (ponts H ou liens phosphodiester) de l’ADN à des séquences spécifiques?
les liens entre le sucre et le phosphate (phosphodiester)
C’est quoi les 2 types de bouts que l’on peut obtenir lorsqu’une enzyme de restriction coupe l’ADN?
- bouts collants/sticky ends
- bouts francs
C’est quoi des sticky ends/bouts collants?
ce sont des morceaux d’ADN non appariés/des bouts libres qui peuvent se rattacher ensemble par eux mêmes par appariement de bases
C’est quoi le système de restriction dans lequel les enzymes de restriction participent?
l’ADN étranger arrive ds la cellule et les enzymes de restriction vont couper l’ADN étranger en petits morceaux
Pourquoi l’ADN de la bactérie n’est pas coupé par le système de restriction même si pourtant il est dans le cytoplasme?
l’ADN de la bactérie est méthylé
Les enzymes de restriction for partie
d’un système de défense contre quoi? en faisant quoi?
contre les virus des bactéries (les bactériophages) en coupant leur ADN en morceaux
Donnez 4 exemples d’enzymes de restriction isolé de bactéries
- EcoRI d’Escherichia coli souche RY13
- HindIII de Haemophilus influenzae
- HaeIII de Haemophilus aegyptius
- BamHI de Bacillus amyloliquefaeciens
HaeIII, HindIII et EcoRI donnent chacun des bouts collants ou francs?
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon quoi? par quoi?
selon la taille par électrophorèse sur gel d’agarose
Lors de l’électrophorèse, la détection se fait par quoi?
Bromure d’Ethidium (=agent intercalant) + UV
Lors de l’électrophorèse, l’ADN est marqué radioactivement par le Bromure d’Ethidium. C’est quoi le Bromure d’Ethidium?
Molécule fluorescente qui s’intercale à l’intérieur de la double hélice
Lors de l’électrophosèse, les puits dans lesquels ont met l’échantillon d’ADN coupé par les enzymes de restriction sont du bord + ou -?
cathode (-)
Lors de l’électrophorèse, les fragments d’ADN vont migrer vers où? pourquoi?
vers l’anode (+) puisque l’ADN est négatif
Lors de l’électrophorèse, quelles sont les fragments qui vont migrer le + loin?
ceux qui ont le poids moléculaire le + petit
Lors de l’électrophorèse toutes les molécules qui ont la meme taille vont faire quoi?
s’aligner au meme endroit et vont former ce qu’on appelle une bande
Deux fragments d’ADN peuvent être joints
dans un processus qui s’appelle quoi?
« Ligation »
le processus « Ligation » permet possiblement la création de quoi au laboratoire? en faisant quoi?
création d’ADN recombinant en joignant
grâce à une ligase et de l’ATP (pour faire un lien covalent: phophodiester) des fragments dans de nouvelles combinaisons
C’est quoi la contrainte nécessaire pour la ligation d’extrémités cohésives?
Bout cohésifs compatibles
L’efficacité de ligation de bouts francs est _______________ que celle de la
ligation de bouts collants
100 fois plus faible
Pourquoi l’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants?
Car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions, tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments d’ADN dépendent de collisions aléatoires
V ou F: Il y a possibilité de ligation d’extrémités franches qui peuvent provenir d’ADNs coupés par des enzymes différents
VRAI (On peut passer de bout collant à bout franc pour le lier à un autre bout franc, mais on peut pas lier bout collant avc bout franc)
C’est quoi un plasmide?
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans organisme hôte
puisqu’un plasmide peut se répliquer de façon autonome dans organisme hôte, il est composé de quoi pour faire cela?
Il a donc une origine de réplication fonctionnelle et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à la réplication dans l’organisme
hôte
c’est quoi un vecteur?
- *Plasmide** contenant des séquences d’ADN requises pour:
- La réplication dans la bactérie (origine de réplication)
- Un gène(s) de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur
- Un site de multicolonage, pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
c’est quoi le clonage?
l’insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide
lors de la réparation de l’ADN recombinant, est-ce qu’il peut y avoir l_‘insertion de plus d’un fragment d’ADN_ dans un vecteur (clonage)?
oui
Quelles sont les utilisations possibles de l’ADN amplifié?
1) pour préparer une grande qte de l’insert afin de séquencer l’insert
2) Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
3) Pour la production de protéines récombinantes
normalement, l’efficacité de la transformation est de cbm?
1 cellule sur 2000 va recevoir le plasmide.
Quelle est la définition de transformation?
C’est l’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure.
Alors, comment ecq’on fait pour identifier les cellules transformées (celles qui ont reçu le plasmide)?
On utilise un marqueur de sélection comme un gène dans le plasmique qui soit résistant à l’ampicilline. On fait alors la culture grandir sur une plaque contenant de l’ampicilline et uniquement des cellules ayant reçu le plasmide vont survivre alors que les autres mourront.
Seulement les cellules résistantes à l’ampicilline formeront des colonies.
On utilise quoi pour faire la production des protéines recombinantes thérapeutiques?
Des vecteurs d’expression.
Explique comme on utilise les vecteurs d’expression pour faire la production des protéines recombinantes thérapeutiques.
1) dans un vecteur avec un promoteur, on utilise un enzyme de restriction pour le couper.
2) suite à la coupure on va ajouter une séquence d’ADN précise qui code pour la protéine que nous désirons obtenir
3) Lorsque la ligase finit la liaison phosphodiester, nous obtenons un ADN recombinant. ; CECI S’AGIT DU CLONAGE DU GÈNE
4) Cette ADN va aller subir nombreux cycles de réplication et à chaque fois le nombre de séquences d’ADN désirées va augmenter et se traduira en la protéine désirée.
5) Suite à la surexpression de la protéine, on la purifie
Explique la fabrication en masse de l’insuline humaine.
Dans le pancréas humain, on isole le gène pour l’insuline. On l’insère dans un plasmide (clonage) et on attend que celui-ci fasse plusieurs réplications et traductions, afin de pouvoir à la fin isoler l’insuline surexprimée.
Que veut dire GFP?
Green fluorescent protéine
C’est quoi la GFP?
C’est une protéine fluorescente de a méduse aequorea victoria.
Quelles sont les 5 fonctions de la GFP?
Elle permet de suivre un gène grâce à sa couleur fluorescente:
1) les niveaux de transcription d’un gène
2) les niveaux de traduction d’un gène
3) le ciblage du gène
4) localisation du gène dans les protéines
5) co-localisation cellulaire.
Au fur et à mesure que la température augmente dans le brin d’ADN, quelle est l’autre composante qui augmente aussi?
L’absorbance à un longueur d’onde de 260nm
Lorsqu’on compare les courbes de dénaturation vues ici en bas, on s’aperçoit que l’ADN poly G-C requiert une plus grande température pour dénature. Pourquoi?
Car les bases G et C sont liées entre elles par 3 ponts H alors que les bases A et T sont liées entre elles par 2 ponts H. Donc G-C est plus stable que A-T et requiert plus d’énergie afin d’être brisé. Cela explique pourquoi l’ADN avec plus de G et C sera plus difficile à dénaturer.
Explique le principe de l’hybridation.
Si une hélice d’ADN est dénaturée en raison de la température ou du pH et devient donc simple brin, la structure d’hélice double brin de l’ADN peut être “restored” si les conditions sont propices.
Lors de la synthèse de l’ADN in vitro, l’amorce est synthétisée par quoi? en fonction de quoi?
Par une machine, selon un séquence d’ADN connue pour qu’il y ait appariement.
Dans la photo-ci jointe, quel est le problème le nucléotide à droite?
Il ne contient pas de OH sur son carbone 3’. Donc, aucun autre nucléotide ne peut venir s’attacher car il n’y a pas de 3’ OH disponible.
quelles sont les 4 étapes de la méthode de Sanger?
1) Séparation des brins d’ADN
2) L’amorce d’ADN s’apparie avec la séquence complémentaire sur la matrice simple brin d’ADN et la polymérisation a alors lieu. Les désoxynucléotides sont ajoutés.
3) Lorsqu’un didéoxynucléotide est ajouté la polymérisation s’arrête et le brin complémentaire se détache.
4) Les différents oligonucléotides sont placés sur le gel electrophoresis agarose et ils vont se déplacer selon leur taille. On peut alors lire base par base la séquence de l’ADN fragmenté.
Explique comment le PCR peut être utilisé sur une scène de crime.
Si un échantillon de sang ou de cheveux est trouvé, l’ADN de cet échantillon peut être utilisé dans la PCR pour obtenir des millions de copies. Cette amplification peut alors permettre de comparer la composition des VNTR trouvé sur le brin de cheveux avec celui des suspects. Les profils identiques montrent alors qui est le coupable.
Quelle est la différence entre un SNP et une mutation?
La fréquence; les mutations arrivent dans moins de 1% de la population alors que les SNP arrivent dans plus de 1%. Donc mm si les deux sont des changement d’une seule base de DNA, la fréquence est différente.
Quels sont les 4 types de SNP?
SNP causatif, lié, des régions condantes et des régions non-condantes.
