Technologie de l'ADN (par: Luiz Alberto) Flashcards
1
Q
C’est quoi les enzymes de restriction?
A
Ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
2
Q
La vaste majorité des enzymes de restriction reconnaissent quel genre de séquences?
A
palindromiques
3
Q
C’est quoi des séquences palindromiques?
A
Une séquence palindromique se lit de la
même façon dans le deux directions
4
Q
L’enzyme de restriction coupent quel liens (ponts H ou liens phosphodiester) de l’ADN à des séquences spécifiques?
A
les liens entre le sucre et le phosphate (phosphodiester)
5
Q
C’est quoi les 2 types de bouts que l’on peut obtenir lorsqu’une enzyme de restriction coupe l’ADN?
A
- bouts collants/sticky ends
- bouts francs
6
Q
C’est quoi des sticky ends/bouts collants?
A
ce sont des morceaux d’ADN non appariés/des bouts libres qui peuvent se rattacher ensemble par eux mêmes par appariement de bases
7
Q
C’est quoi le système de restriction dans lequel les enzymes de restriction participent?
A
l’ADN étranger arrive ds la cellule et les enzymes de restriction vont couper l’ADN étranger en petits morceaux
8
Q
Pourquoi l’ADN de la bactérie n’est pas coupé par le système de restriction même si pourtant il est dans le cytoplasme?
A
l’ADN de la bactérie est méthylé
9
Q
Les enzymes de restriction for partie
d’un système de défense contre quoi? en faisant quoi?
A
contre les virus des bactéries (les bactériophages) en coupant leur ADN en morceaux
10
Q
Donnez 4 exemples d’enzymes de restriction isolé de bactéries
A
- EcoRI d’Escherichia coli souche RY13
- HindIII de Haemophilus influenzae
- HaeIII de Haemophilus aegyptius
- BamHI de Bacillus amyloliquefaeciens
11
Q
HaeIII, HindIII et EcoRI donnent chacun des bouts collants ou francs?
A
12
Q
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon quoi? par quoi?
A
selon la taille par électrophorèse sur gel d’agarose
13
Q
Lors de l’électrophorèse, la détection se fait par quoi?
A
Bromure d’Ethidium (=agent intercalant) + UV
14
Q
Lors de l’électrophorèse, l’ADN est marqué radioactivement par le Bromure d’Ethidium. C’est quoi le Bromure d’Ethidium?
A
Molécule fluorescente qui s’intercale à l’intérieur de la double hélice
15
Q
Lors de l’électrophosèse, les puits dans lesquels ont met l’échantillon d’ADN coupé par les enzymes de restriction sont du bord + ou -?
A
cathode (-)
16
Q
Lors de l’électrophorèse, les fragments d’ADN vont migrer vers où? pourquoi?
A
vers l’anode (+) puisque l’ADN est négatif
17
Q
Lors de l’électrophorèse, quelles sont les fragments qui vont migrer le + loin?
A
ceux qui ont le poids moléculaire le + petit
18
Q
Lors de l’électrophorèse toutes les molécules qui ont la meme taille vont faire quoi?
A
s’aligner au meme endroit et vont former ce qu’on appelle une bande
19
Q
Deux fragments d’ADN peuvent être joints
dans un processus qui s’appelle quoi?
A
« Ligation »
20
Q
le processus « Ligation » permet possiblement la création de quoi au laboratoire? en faisant quoi?
A
création d’ADN recombinant en joignant
grâce à une ligase et de l’ATP (pour faire un lien covalent: phophodiester) des fragments dans de nouvelles combinaisons
21
Q
C’est quoi la contrainte nécessaire pour la ligation d’extrémités cohésives?
A
Bout cohésifs compatibles
22
Q
L’efficacité de ligation de bouts francs est _______________ que celle de la
ligation de bouts collants
A
100 fois plus faible
23
Q
Pourquoi l’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants?
A
Car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions, tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments d’ADN dépendent de collisions aléatoires
24
Q
V ou F: Il y a possibilité de ligation d’extrémités franches qui peuvent provenir d’ADNs coupés par des enzymes différents
A
VRAI (On peut passer de bout collant à bout franc pour le lier à un autre bout franc, mais on peut pas lier bout collant avc bout franc)
25
C'est quoi un **plasmide**?
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui **peut se répliquer de façon autonome dans organisme hôte**
26
puisqu'un **plasmide** peut _se répliquer de façon autonome_ dans organisme hôte, il est composé de quoi pour faire cela?
Il a donc une **origine de réplication fonctionnelle** et les **gènes** spécifiques qui **codent pour** des **protéines nécessaires à** la **réplication** dans l’organisme
hôte
27
c'est quoi un **vecteur**?
* *Plasmide** contenant des séquences d’ADN requises pour:
- La réplication dans la bactérie (**origine de réplication**)
- Un _gène(s) de sélection_ (**résistance à des antibiotiques**), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur
- Un **site de multicolonage**, pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
28
c'est quoi le **clonage**?
l’insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide
29
lors de la réparation de l’ADN recombinant, est-ce qu'il peut y avoir l_'insertion de plus d’un fragment d’ADN_ dans un vecteur (**clonage**)?
oui
30
Quelles sont les utilisations possibles de l'ADN amplifié?
1) pour préparer une grande qte de l'insert afin de séquencer l'insert
2) Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
3) Pour la production de protéines récombinantes
31
normalement, l'efficacité de la transformation est de cbm?
1 cellule sur 2000 va recevoir le plasmide.
32
Quelle est la définition de transformation?
C'est l'introduction d'un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure.
33
Alors, comment ecq'on fait pour identifier les cellules transformées (celles qui ont reçu le plasmide)?
On utilise un marqueur de sélection comme un gène dans le plasmique qui soit résistant à l'ampicilline. On fait alors la culture grandir sur une plaque contenant de l'ampicilline et uniquement des cellules ayant reçu le plasmide vont survivre alors que les autres mourront.
Seulement les cellules résistantes à l'ampicilline formeront des colonies.
34
On utilise quoi pour faire la production des protéines recombinantes thérapeutiques?
Des vecteurs d'expression.
35
Explique comme on utilise les vecteurs d'expression pour faire la production des protéines recombinantes thérapeutiques.
1) dans un vecteur avec un promoteur, on utilise un enzyme de restriction pour le couper.
2) suite à la coupure on va ajouter une séquence d'ADN précise qui code pour la protéine que nous désirons obtenir
3) Lorsque la ligase finit la liaison phosphodiester, nous obtenons un ADN recombinant. ; CECI S'AGIT DU CLONAGE DU GÈNE
4) Cette ADN va aller subir nombreux cycles de réplication et à chaque fois le nombre de séquences d'ADN désirées va augmenter et se traduira en la protéine désirée.
5) Suite à la surexpression de la protéine, on la purifie
36
Explique la fabrication en masse de l'insuline humaine.
Dans le pancréas humain, on isole le gène pour l'insuline. On l'insère dans un plasmide (clonage) et on attend que celui-ci fasse plusieurs réplications et traductions, afin de pouvoir à la fin isoler l'insuline surexprimée.
37
Que veut dire GFP?
Green fluorescent protéine
38
C'est quoi la GFP?
C'est une protéine fluorescente de a méduse aequorea victoria.
39
Quelles sont les 5 fonctions de la GFP?
Elle permet de suivre un gène grâce à sa couleur fluorescente:
1) les niveaux de transcription d'un gène
2) les niveaux de traduction d'un gène
3) le ciblage du gène
4) localisation du gène dans les protéines
5) co-localisation cellulaire.
40
POLYMÉRISATION DE L'ADN IN VITRO
l'ADN polymérase peut juste ajouter des nucléotides dans quelle direction?
de 5' à 3'.
41
l'ADN polymérase peut juste ajouter des nucléotides si \_\_\_\_\_
il y a un un 3'OH libre sur un brin simple matrice.
42
ecq l'ADN polymérase peut initier sa réplication à partir de rien?
Non
43
Le besoin d'un amorce pour l'ADN polymérase est comblé par quoi in vitro?
Par un oligonucléotide ADN ou ARN, 3' du brin de l'ADN en polymérisation.
44
Qcqui permet d'obtenir la matrice simple brin in vivo?
L'hélicase qui vient ouvrir la double hélice de l'ADN.
45
Qcqui permet d'obtenir la matrice simple brin in vitro?
La dénaturation de la double hélice d'ADN grâce à la température; on chauffe jusqu,au point où l'ADN s'ouvre.
46
Au fur et à mesure que la température augmente dans le brin d'ADN, quelle est l'autre composante qui augmente aussi?
L'absorbance à un longueur d'onde de 260nm
47
Lorsqu'on compare les courbes de dénaturation vues ici en bas, on s'aperçoit que l'ADN poly G-C requiert une plus grande température pour dénature. Pourquoi?
Car les bases G et C sont liées entre elles par 3 ponts H alors que les bases A et T sont liées entre elles par 2 ponts H. Donc G-C est plus stable que A-T et requiert plus d'énergie afin d'être brisé. Cela explique pourquoi l'ADN avec plus de G et C sera plus difficile à dénaturer.
48
Explique le principe de l'hybridation.
Si une hélice d'ADN est dénaturée en raison de la température ou du pH et devient donc simple brin, la structure d'hélice double brin de l'ADN peut être "restored" si les conditions sont propices.
49
Renaturation = hybridation = \_\_\_\_\_\_\_
re-appariement des bases.
50
Lors de la synthèse de l'ADN in vitro, l'amorce est synthétisée par quoi? en fonction de quoi?
Par une machine, selon un séquence d'ADN connue pour qu'il y ait appariement.
51
Quels sont les deux noms donnés à la méthode de terminaison de la chaîne?
La méthode de Sanger ou didéoxy.
52
La méthode de Sanger peut être utilisée pour détecter quoi (par exemple)?
Une mutation dans un gène
53
Quel est le but de la méthode de Sanger?
Déterminer la séquence d'un fragment d'ADN.
54
Dans la photo-ci jointe, quel est le problème le nucléotide à droite?
Il ne contient pas de OH sur son carbone 3'. Donc, aucun autre nucléotide ne peut venir s'attacher car il n'y a pas de 3' OH disponible.
55
Quels sont les composantes nécessaires de la méthode de Sanger?
- Séparation du brin d'ADN en deux
- Ajout dans la solution des 4 bases désoxynucléotides (dA, dT, dC et dG), d'une amorce d'ADN, 1 didéoxynucléotide
- ADN polymérase pour la polymérisation
56
quelles sont les 4 étapes de la méthode de Sanger?
1) Séparation des brins d'ADN
2) L'amorce d'ADN s'apparie avec la séquence complémentaire sur la matrice simple brin d'ADN et la polymérisation a alors lieu. Les désoxynucléotides sont ajoutés.
3) Lorsqu'un didéoxynucléotide est ajouté la polymérisation s'arrête et le brin complémentaire se détache.
4) Les différents oligonucléotides sont placés sur le gel electrophoresis agarose et ils vont se déplacer selon leur taille. On peut alors lire base par base la séquence de l'ADN fragmenté.
57
Comment se nomme l'amorce utilisée dans la méthode se Sanger?
C'est l'oligonucléotide.
58
Quelle est la longueur de l'oligonucléotide?
De 15-30 nucléotides.
59
que veut-dire PCR?
Polymerase chain reaction
60
le polymérase chain reaction requiert quel type d'ADN polymérase pour fonctionner?
Pourquoi?
la Taq ADN polymerase car elle est très résistante au température élévées et ne va pas se dénaturer.
61
La Taq DNA polymera provient d'où?
Du thermus aquaticus, une bactérie.
62
Quelles sont les 3 étapes de la PCR?
1) Dénaturation de la double hélice d'ADN (96 degrés)
2) Hybridation des amorces (55 degrés)
3) Synthèse par la Taq DNA polymérase (70 degrés)
63
Quel est le but de la PCR?
Prendre un morceau d'ADN et faire des millions de copies très rapidement
64
La PCR a besoin de quoi pour fonctionner?
De la Taq DNA polymérase, de l'ADN, des amorces anneal, des désoxynucléotides
65
Explique les étapes de la PCR (décrites)
L'ADN double brin est dénaturalisé par la chaleur et les deux brins sont deviennent des brins matrices simples, la température est baissée et alors les primers ANNEAL peuvent s'hybrider avec les simples brins d'ADN.
La température est alors augmenté et l'ADN polymérase Taq peut venir et faire la polymérisation des brins complémentaires.
66
Les amorces sont les plus spécifiques dans quelle situation?
Lorsqu'elle sont plus longues (15-30 nucléotides normalement, donc plus vers 30 nctds) car elles vont juste s'apparier une seule unique fois sur le brin matrice.
67
Plus les VNTR sont \_\_\_\_\_\_\_, plus il est utile dans ce test de profil génétique pour déterminer la paternité.
Polymorphique
68
Ecq chaque individu possède le mm nombre de variable number repeats?
Non, en raison des polymorphismes les nombres diffèrent d'un individu à un autre. Ainsi, on peut utiliser méthode pour trouver l'identité d'un individu.
69
Explique comment le PCR peut être utilisé sur une scène de crime.
Si un échantillon de sang ou de cheveux est trouvé, l'ADN de cet échantillon peut être utilisé dans la PCR pour obtenir des millions de copies. Cette amplification peut alors permettre de comparer la composition des VNTR trouvé sur le brin de cheveux avec celui des suspects. Les profils identiques montrent alors qui est le coupable.
70
sinon le VNTR polymorphisme, quel est l'autre type de polymorphisme?
Le SNP -- single nucleotide polymorphism
71
Le SNP compte pour quel % des variations génétiques humains?
90
72
Si on prend deux individus aléatoires, cbm de % de leur séquence d'ADN est identique?
99.9%
73
Quelle est la cause de ce 0.1% de différence entre deux individus aléatoires?
Les changements d'une base, des variations qui caractérisent chaque individu génétiquement.
74
Comment se nomme les sites où les individus possèdent des variations d'une seule base d'ADN?
Les simple nucleotide polymorphism
75
C'est quoi le "snip"?
C'est lorsqu'une variation génétique d'une base d'ADN d'un individu est maintenue par héréditée.
76
Les snips arrivent cbm de fois par génome?
1 fois à toutes les 300 nuclétoides.
Donc si le génome a 3 milliards de nucléoties, il a 10 millions de snips.
77
Ensemble, les snips créent quoi?
Un motif d'ADN unique pour chaque personne.
78
Les rôles jouent quel rôle dans le traitement et la compréhension des maladies humains?
Ils aident considérable à la compréhension.
79
Ecq les SNP sont des cas aléatoires?
Non, ce sont des variantes dans la population. Ils permettent donc de distinguer une population d'une autre.
80
Quelle est la différence entre un SNP et une mutation?
La fréquence; les mutations arrivent dans moins de 1% de la population alors que les SNP arrivent dans plus de 1%. Donc mm si les deux sont des changement d'une seule base de DNA, la fréquence est différente.
81
V ou F
Les SNP peuvent déterminer si une personne est en santé ou très malade.
Vrai
82
Les femmes qui ont une mutation du gène BRCA-1 souffrent de quoi?
Elles ont 7 fois plus de chances d'avoir le cancer du sein
83
Que se passe-t-il si on manque CTT a un site spécifique du génome?
On peut être atteints de Fibrose kystique si on est homozygote pour cet allèle.
84
Les single nucléotide polymorphs peuvent être associés avec quels traits génétiques?
La couleur des yeux et des cheveux, la performance musculaire, le comportement social, l'hérédité et susceptibilité à des maladies et la réponse individuelle aux médicaments.
85
Quels sont les 4 types de SNP?
SNP causatif, lié, des régions condantes et des régions non-condantes.
86
Le SNP causatif fait quoi?
Il cause un trait génétique.
87
Le SNP lié fait quoi?
Il se situe à côté d'une séquence de gènes codant pour un trait spécifique et ne cause pas le trait mais sert comme marqueur.
88
Le SNP des régions codantes fait quoi?
Il va affecter l'expression et la fonction la protéine
89
Le SNP des régions non-codantes fait quoi?
Il n'affecte pas les protéines mais joue un rôle dans l'épissage, la maturation du pré-mARN, le niveau d'expression et la régulation d'un gène.
90
Quelle est la définition d'haplotype?
C'est un ensemble de variation d'ADN ou de polymorphismes qui ont tendance à être hérités ensemble.
91
Peut-t-on se réfèrer à une combinaison d'allèles ou à un esmble de SNPs se trouvant sur le même chromosome comme étant un *haplocyte?*
Oui
92
Il faut un très grand nombre de SNPs afin d'identifier de manière unique un haplotype.
V ou F
Faux, un ou quelques SNPs suffisent à identifier de manière unique un haplotype.
93
Quel est le but du projet HapMap?
Ils veulent faire une carte de ces blocs d'haplotypes, afin de réduire le nombre de SNPs requis pour examiner l'ensemble du génome pour l'association avec un phénotype (maladie, sensibilité, etc)
94
Quel est le nom des SNPs spécifiques utilisés pour identifier les haplotypes?
les SNPs étiquettes.
95
Si le HapMao project arrive à simplifier les 10 millions de SNPs d'un organisme à 500K SNPs d'étiquette, cela permettra quoi?
Une étude bcp plus rapide et efficace du génome de l'individu et donc il sera plus facile de trouver les maladies et de les traiter.
96
Quels sont 3 rôles clés que le HapMap pourrait permettre de réaliser?
1) Identifier les différences génétiques dans la population qui permettront de **prédire la susceptibilité à des maladies**
2) **Développer des tests génétiques pour prédire si un individu aura une maladie ou non**
3) Offrir un **traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie**
97
Quels sont les deux facteurs qui nous poussent à développer de la médecine personnalisée?
Aux USA, 106k personnes meurent à chaque année en raison d'un médicament correctement prescrits et 2.2M ont des effets secondaires graves. Donc si on est capables de déterminer comme l'organisme d'une personne réagira à une maladie, on pourra mieux prescrire des médicaments.
98
C'est quoi la médicine personnalisée?
C'est l'utilisation de méthodes d'analyse génétique afin de pouvoir avoir la séquences génétique complètes de toutes les personnes avec tous leurs SNPs. On pourra alors transcrire les médicaments qui réagiront le mieux en fonction du profil génétique et environnemental de chaque patient.
