Techniques de laboratoire pour la transcription bactérienne (CC1) Flashcards
L’ARN pol ADN dépendante : Quel sens de synthèse ? Peut-elle ouvrir la double hélice d’ADN ?
Synthèse de 5-3’. Capable d’ouvrir la double hélice d’ADN.
L’ARN pol ADN dépendante : besoin d’amorce ? A-t-elle une activité 3’5’ Exonucléase ?
Non, pas besoin d’amorce mais n’a pas l’activité exonucléase.
Combien trouve-t-on d’ARN polymérases chez les bactéries et chez les eucariotes ?
Une seule chez les bactéries contre 3 chez les eucariotes.
Dans une cellule bactérienne, une seule ARN polymérase permet la synthèse de quels ARNs ?
Des ARNt, ARNr et ARNm.
Ou se situe le promoteur chez les bactéries ?
On le retrouve dans la région 5’ du site d’initiation, c’est à dire en amont de la région +1.
Comment se fixe l’ARNpol sur l’ADN, chez les bactéries ?
Elle s’y fixe directement.
Comment sont sélectionnés les NTPs lors de la transcription bactérienne ?
Il sont sélectionnés par complémentarité des bases.
Quelle liaison lie deux bases entre elles ?
La liaison 5’3’ Phosphodiester.
Donner les trois étapes de la transcription, avec une description générale.
Initiation : mise en place de la machinerie de transcription et formation du complexe PIC.
Elongation : addition séquentielle des nucléotides.
Terminaison : libération de l’ADN.
Qu’appelle-t-on le complexe PIC ?
C’est le Pre Initiation Complex. Il positionne la polymérase sur le site d’initiation, dénature l’ADN et le place dans la RNA Pol.
Définir promoteur.
Un promoteur est une région de l’ADN renfermant des motifs reconnus spécifiquement par les protéines impliquées dans le mécanisme de l’initiation de la transcription.
Comment se fait la reconnaissance d’un promoteur par les ARN polzmérases euca ou bactériens ?
Chez les bactéries, il est directement reconnu par la ARNpol. Chez les eucariotes, il est reconnu par un facteur de transcription spécifique de l’ARNpol.
A quoi correspond la région +1 ?
C’est le site d’initiation de la transcription, correspondant au premier nucléotide incorporé dans l’ARNpol (Généralement purine).
Comment peut-on mettre en évidence la fixation d’un facteur de transcription sur une séquence spécifique de l’ADN ?
On fait l’expérience du retard sur gel.
Décrire brièvement l’expérience de retard sur gel.
On prend un fragment d’ADN, radioactif. On l’incube (en excès) en présence de protéines suceptibles de s’y accrocher dans des conditions propices. Puis, on le fait migrer sur un gel : si il y a eu association, le complexe ira plus lentement que le témoin d’ADN libre.
Admettons que en faisant une expérience de retard sur gel, on observe trois bandes dans un puits dont l’une est celle correspondant à de l’ADN libre. Que cela signifie ?
Que la protéine spécifique peut se lier sur deux sites dans la séquence d’ADN étudiée.
Décrire brièvement l’expérience d’emprunte à la DNase I, ainsi que sa fonction.
Il s’agit d’incuber des séquences d’ADN liées par des protéines avec des endonucléases. S’ensuit une séparation selon taille par gel, puis une autoradiographie : une comparaison avec des séquences d’ADN non liées révèle l’endroit ou la protéine liée a empêché l’action endonucléase : permet d’identifier la position, et donc la séquence du site de fixation.
Décrire brièvement l’expérience d’interférence et sa fonction.
Fonction : identifier les bases en contact étroit avec une protéine.
On modifie chimiquement l’ADN (utlisation de DMS) : si il n’y a pas formation du complexe, cela indique que le nucléotide méthylé était important.
On identifie ensuite le nucléotide modifié en le supprimant de la séquence, et en faisant un fractionnelement sur gel de polyacrylamide (dénaturant).
Qu’est-ce que le ChIP ?
C’est une technique d’immunoprécipitation qui met en évidence un facteur de transcription fixé qu niveau de l’ADN génomique.
Donner les 3 étapes d’une immunoprécipitation.
1) L’anticorps se fixe spécifiquement
2) Chromato d’affinité qui retient les complexes anticorps/protéine.
3) Lavage et élution.
Que faut-il faire pour préparer une chip ?
- Casser les cellules pour prep la chromatine.
- Stabiliser les interactions ARN/prot
- Solubiliser la chromatine
Que représente le pic obtenu en faisant une CHiP ?
Le pic représente le motif reconnu par la protéined’interêt.
Qu’est-ce que le criblage d’une banque d’expression ?
On insère de l’ADNc codant pour une protéine spécifique avec un vecteur dans une bactérie transformée, puis on transfère les bactéries sur un filtre. on ajoute un ADN marqué contenant la séquence cible du facteur de transcription à cloner. Les complexes sont trouvés par radiographie après lavage.
