Spectrofluorimétrie Quinine + chlorures Flashcards
Intro-Propriétés spectre excitation/émission quinine
Absorbe ds UV
Émet ds visible
Intro-Échantillon commercial
Eau Tonique Nos Comliments
Intro- Quels autres trucs vs avez faits
Spectre excitation/émission pour quinine et nitrate d’uranyle
Intro-Objectif du lab = quoi
Familiarise étudiant avec méthode analyse spectrofluorimétrique ds lab quantitatif
Intro-Comparer deux méthodes d’étalonnage, lesquelles + analyses faites (quinine, chlorure?)
Ajouts dosés vs étalonnage
Analyse:
- analyse qunine
- extinction (quenching) de la fluorescende la quinie par les ions chlorures
Intro-Modèle de l’instrument
Aminco-Bowman série 2
Intro-Source = quoi + caractéristiques ( 2+ et pourquoi et 1 - et sln)
Lampe Xe
+: Forte intensité lumineuse, émet continuum de raies donc besoin monochromateur
Intensité signal est proportionnel à lumière incidente
-: Fluctuation de l’intensité lumineuse ds le temps
Sln pour fluctuation de source- deux PMT (1 détecteur pour la source et un pour l’échantillon)
Intro-Comment ça marche en terme de monochromateur + plusieurs monochromateurs + nom du détecteur et plusieurs en fct de excitation et émission + placés où?
Excitation
1) Lumière produite par source passe par monochromateur pour n’émettre sur l’échantillon qu’une longueur d’onde à la fois
PMT référence pour me surer intensité fluctuante de la source, placé entre monochromateur excitation et échantillon
Émission
2)Lumière émise par fluorescence passe ds un autre monochromateur et est captée par détecteur type PMT
PMT pour mesurer intensité de la fluorescence émise par l’échantillon, placé après le monochromateur d’émission
Intro-Détecteur PMT (photomultiplier tube)est composé de quoi-physiquement + fait quoi
Ampoule de verre sous vide contenant photocathode et une série d’anodes
Multiplie le signal électrique généré par chaque photon
Effet de cascade
Intro-Photocathode dans PMT (détecteur- photomultiplier tube) marche comment (oui, oui, vous aurez pas toute la réponse, mais plusieurs questions séparées= dla marde si elles sont pas posées à la suite)!
Plaquette verrre recouverte fine couche semi-conducteur déposé
Photon frappe cathode = couple trou-électron. Cet é- est éjecté de la photocathode à cause d’une grande différence de potentiel
É- va à la première anode puis aux anodes suivantes
Différence entre chaque anode = plus grande différence de potentiel que la précédente
Intro-Détecteur PMT -caractéristiques générales + 1 problème de ce détecteur
Très sensible
Maximise valeur transmise pour quantité lumière reçue
So, si tu en as trop sur le détecteur, tu peux le brûler, car l’amplification va être trop grande
Intro-axe du détecteur est à 90 degrés par rapport au faisceau d’excitation
Minimiser l’intensité lumineuse incidente en provenance de la source, car on veut juste l’intensité de la fluorescence
Intro-Miroirs + fentes servent à quoi
Miroirs= converger / diverger faisceaux
Fentes ajustables permettant de doser la lumière employée
Intro-Pour ce lab, est-ce que j’aurais pu prendre une cellule de verre
Non, longueur d’onde ds UV et verre bloque une partie importante des UV, donc prendre cellule quartz
Intro-Comment déterminer lambda excitation et émission
1 Mesuré par spectre 3D du niveau de fluorescence selon lambda chacun des 2 paramètres
Permet d’évaluer où sont les maximas
2
Spectre émission: mesuré intensité fluorescence à lambda excitation fixe
Spectre excitation: mesuré intensité fluorescence à lambda émission fixe
Pour connaître précisément les lambdas à utiliser
Intro- Pourquoi analyser le nitrate d’uranyle + acide + spectres uranyle vs quinine
Pourquoi: analyse d’un autre composé fluorescent
Ions uranyle qui font fluorescence, présence orbitales F
pourquoi acide? = assurer solubilité ions uranyle
Spectre uranyle vs quinine:
- uranyle = molécule simple, pics mieux différenciés et résolus, car moins de niveaux vibrationnels
- quinine- pics se superposent
Intro-Étalonnage externe vs ajouts dosés- OK encore shitload de stock mais ouin….
Étalonnage externe:
- caractéristiques = simple, peu manip, gradient concentration analyte (dilution SM quinine en poudre à 90% + acide= garder solubilité)
- avantages = peu manip vs ajouts dosés, plus facile que grosses manip de ajouts dosés pour gens ayant peu d’expérience en labo
Ajouts dosés:
- robuste
- V inconnu à doser = ajouté à chacun des étalons qui contiennent un gradient de concentration analyte
- but = limiter effets de matrice qui pourraient avoir une influence si un autre composé était fluorescent ou phosphorescent aux lambdas employées
- est-ce qu’il y a un blanc en ajouts dosés, non, contient un volume d’inconnu mais pas d’étalon
- volume inégal de sln dans le contenant? non, validité méthode en dépend
Intro- Extinction, autre nom + ce que ça fait avec quel composé
Autre nom = quenching
Extinction des propriétés fluorescentes de la quinine par les ions chlorures du nacl
Intro-Extinction dynamique ou statique + relation proportionnelle entre l’agent d’extinction et la molécule de quinine?
Dynamique, car désactive fluorescence quinine par collision
Quenching est pas proportionnel à un ion cl- pour une molécule de quinine
Intro-Extinction statique veut dire quoi
Agent ajouté (ex chlorure) formerait un complexe avec l’analyte qui n’est pas actif en fluorescence
Théorie-Diffusion Raman-apparait sur spectre de quoi?
Transfert d’une partie de la radiation excitatrice au solvant sous forme d’énergie de vibration-émission
Théorie-Diffusion Rayleigh-apparait sur spectre de quoi?
Réémission, par le solvant, d’une fraction de la radiation excitatrice à la même longueur d’onde-émission
Théorie-Déplacement de Stokes
Lumière produite en fluorescence est tjrs décalée vers le rouge
Théorie- E excitation plus grande ou plus petite que E émission?
Plus grande, car électron perd de l’énergie entre la phase d’excitation et la phase d’émission (relaxation)
Théorie-Quelle longueur d’onde est plus grande excitaiton ou émission?
Longueur d’onde émission est tjrs plus grande que longueur d’onde d,excitation
Discussion-Analysé quoi par méthode d’ajouts dosés?
Eau tonique Nos Compliments
Discussion-Valeur référence pour la quinine ds l’eau tonique sur la bouteille?
Non, valeur FDA
Discussion- pourquoi durant mesure instrument était réglé à 60% au lieu de 80% (aucune idée de l’unité….)
À 80%, détecteur était saturé, donc diminuer pour éviter d’endommager le PMT, trop de luimière= le faire cramer
Discussion-Biais sur résultats (3) + conséquences
manque auto-absorption
1) préparation des étalons pour l,ajout dosé = bcp manip (pesée quinine solide, mise en sln, dilution SM, dilution H2O tonique, préparation des étalons)
possible pertes de transfert
2) Mesure prise par instrument variait avec le temps: moyenne des valeurs ponctuelles = pas nécessairement vraie valeur moyenne
3) pouvoir fluoresence de la quinine diminuaut quand échantillon restait longtemps ds l’instrument
hypothèse= intensité lampe Xe trop élevée= endommagerait la molécule, donc diminuerait propriétés fluorescentes de la quinine= sous-estimation concentration
Discussion-Auto-absorption = quoi?
Molécules analytes excitées émettent lambda qui est aussi une raie d’absorption de cet analyte. Donc, photon produit par fluorescence ne se rend pas au détecteur et on sous-estime concentration
Important si concentration élevée, car ça se passe plus
Discussion-Quenching-quel composé le fait
Ion chlorure
Discussion-graphique de Intensité signal en fonction de concentration chlorure donne quoi comme allure + indique quel type de quenching
Relation logarithmique, plateau atteint rapidement donc quenching dynamique
Discussion- graphique pour quenching statique
Linéaire
Discussion-avantages de spectrofluorimétrie (3)
Non-destructrice
Peu sln pour fonctionner (seulement ce qu’il y a ds la cellule)
Coûteux à l’achat, mais moins cher que HPLC mettons, car pas de volumes importants d’éluants
Discussion-quels analytes en spectrofluorescence
Échantillons qui fluorescent
Discussion- poursuite en terme de réplicas pour améliorer
Faire plus de réplicas pour diminuer influence de la variation de l’intensité de la lampe
Mais il y a aussi le PMT pour compenser les variations de la source….
