Southern blot, northern blot, S1 mapiranje i RT-PCR

Question 1

što je Southern blotting

Answer 1

molekularno-genetička metoda (osniva se na analizi DNA) - hibridizacija DNA metodom po Southern-u

Question 2

koja je primjena southern blota

Answer 2

pretraživanje genomske banke (banke gena)
analiza transformanata i konstruiranih sojeva (da budemo sigurni da se naš insert nalazi točno na onom dijelu gdje i treba biti)…

Question 3

što omogućava southern blot

Answer 3

Nakon (restrikcije) i elektroforeze, omogućava vizualizaciju (detekciju) samo onih fragmenata DNA koji sadrže određeni slijed nukleotida (komplementaran s probom) - RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism (polimorfizam
restrikcijskih fragmenata) – nakon provedene metode različiti uzorci daju različite fragmente DNA
–> omogućava da se u smearovima, razmazima vizualizira dio koji nas zanima

Question 4

objasni postupak southern blota

Answer 4

1. transformacija kvasca Δarg4 s nereplikativnom DNA (koja se ne može replicirati u st. kvasca) koja sadrži gen ARG4 (dolazi do komplementacije mutacije)
2. transformanti selekcionirani na podlozi bez arginina
3. iz pojedinačnih kolonija transformanata izolirana DNA
4. provodi se pulsirajuća elektroforeza cijelih (nativnih, intaktnih) kvaščevih kromosoma
5. Southern blotting (hibridizacija s genom ARG4) - proba je neradioaktivno označen gen ARG4
   DNA iz gela je preslikana na membranu koja se stavi u otopinu u kojoj je fragment gena arg4 i on hibridizira, tj. komplementarno se sparuje s DNA na membrani (DNA transformanata) , taj gen arg4 je neradioaktivno obilježen tako da ga možemo vizualizirati –> fragment arg4 se ugradio u različite kromosome kvasca

Question 5

kakve se DNA mogu detektirati southern blotom

Answer 5

Southern blotting-om se može detektirati puno manja količina DNA
to je jako osjetljiva metoda (puno bolje se vide male količine DNA ovom metodom nego iste te količine na gelu za elektroforezu)

Question 6

još jedanput objasni postupak southern blota

Answer 6

(1) gel-elektroforeza pocijepane ili nepocijepane DNA (može, ali i ne mora prethoditi restrikcija)
(2) prijenos DNA iz gela na membranu (najlonska, pozitivno nabijena) - transfer
(3) hibridizacija s probom (radioaktivno ili neradioaktivno obilježena DNA) - komplementarno sparivanje probe i DNA vezane na membranu
(4) detekcija komplementarno sparene probe (na membrani) - vizualizacija mjesta na kojem je kompl. sparena sonda

Question 7

objasni prijenos DNA na membranu - transfer

Answer 7

1. provodi se elektroforeza, bojanje u etidij-bromidu i fotografiranje na UV-transiluminatoru
2. gel se inkubira 10 min u 0,25 M HCl
   - djelomična depurinacija – fragmentiranje DNA (lakši transfer manjih fragmentata)
   - samo za fragmente veće od 20 kb
3. gel isprati u vodi te inkubirati 10 min u 1 M NH4Ac / 0,4 M NaOH
4. denaturacija DNA

Question 8

koje vrste transfera postoje

Answer 8

kapilarni
elktro
vakuum

Question 9

objasni hibridizaciju

Answer 9

1. nakon transfera, membranu inkubirati 15 min u 1 M NH4Ac
2. vezanje DNA na membranu (neg. nabijena DNA se vezala na poz. nabijenu membranu) - zagrijavanjem 30 min na 120°C ili djelovanjem UV-a uzroku trajno vezanje DNA na membranu
3. membranu inkubirati 2-3 sata pri 68°C u predhibridizacijskoj otopini koju čine soli, SDS, velika količina nespecifična DNA (zasićivanje, blokiranje membrane – da se spriječi nespecifično vezanje probe na membranu); u zataljenoj vrećici u vodenoj kupelji, uz miješanje (potresanje)
4. denaturirati probu (sondu, obilježenu DNA) - zagrijati 10 minuta pri 95°C te naglo ohladiti u ledu
5. probu dodati u predhibridizacijsku otopinu (hibridizacijska otopina) i u njoj
   inkubirati membranu 16-20 sati pri 68°C uz potresanje - ako proba nije potpuno homologna ciljanoj sekvenciji, hibridizacija se provodi na nešto nižoj temperaturi

Question 10

objasni detekciju DNA kod southern blota

Answer 10

1. priprema membrane za vezanje protutijela (antiDIG-fosfataza) - višekratno ispiranje membrane (na sobnoj temperaturi i pri 68°C), dolazi do uklanjanja nespecifično vezane probe
2. blokiranje membrane proteinima, zasićuje se membrana proteinima (sobna temperatura, 1 sat, potresanje) - sprječavanje nespecifičnog vezanja protutijela antiDIG-fosfataza
3. vezanje protutijela antiDIG-fosfataza - 30 minuta pri sobnoj temperaturi uz potresanje
4. kolorna reakcija - membranu zataliti u vrećicu s odgovarajućim puferom i: “X-fosfat” (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat)
   - supstrat za alkalnu fosfatazu; i NBT (“nitroblue tetrasolium salt”) - indikator (daje ljubičasto obojenje)
   - inkubirati u mraku pri 37°C do pojave vrpci na membrani
   - prekinuti reakciju ispiranjem membrane u TE-puferu ili vodi
   - osušiti i skenirati ili fotografirati membranu

Question 11

objasni northern blot

Answer 11

princip isti kao i kod southerna samo što se radi elektroforeza RNA
izolacija mRNA (eukariotska mRNA s može vezati na kolonu koja sadrži poliT)
agarozna gel-elektroforeza u denaturirajućim uvjetima - odjeljivanje molekula mRNA po veličini
prijenos na membranu
hibridizacija s obilježenom probom (najčešće DNA)
detekcija i kvantifikacija

Question 12

za što se koristi northern blot

Answer 12

za analizu i kvantifikaciju mRNA u stanici (ekspresija gena na razini transkripcije)

Question 13

koji se problem javlja kod northern blota

Answer 13

prisutnost RNaze (ima ih na koži, teško se inaktiviraju, za aktivnost ne trebaju dvovalentne katione)

Question 14

za što se koristi RT-PCR - reverse transcription PCR

Answer 14

za analizu i kvantifikaciju mRNA u stanici (ekspresija gena)

Question 15

objasni RT-PCR

Answer 15

sinteza DNA na mRNA kalupu - reverzna transkripatza i klica (specifična za neku mRNA ili oligo-dt)
PCR - termorezistentna DNA-polimeraza i druga specifična klica
kvantifikacija - (qPCR)

Question 16

za što se koristi S1 mapiranje

Answer 16

za određivanje broja i veličine egzona

Question 17

objasni princip S1 mapiranja

Answer 17

komplementarno sparivanje mRNA s obilježenom DNA
degradacija nesparenih regija
elektroforeza, detekcija