fagmidi, yac i ekspresijski vektori

Question 1

što su fagmidi

Answer 1

-plazmidi koji sadrže dio genoma filamentoznih jednolančanih DNA-virusa (M13, f1, fd), imaju ishodište replikacije (IGR, regija f1, f1-ori; ~500 pb)
-plazmidi koji imaju IGR regiju i kao genetički materijal imaju jednolančanu DNA
-imaju sva svojstva plazmidnog vektora ali se iz E. coli, osim u dvolančanom, mogu izolirati i u jednolančanom obliku

Question 2

za što se koristi jednolančana DNA

Answer 2

pri određivanju redosljeda nukleotida (sekvencioniranje)
za pripremu “označene” DNA
u postupku “ciljane in vitro mutageneze po Kunkelu”

Question 3

što su filamentozni jednolančani DNA virusi

Answer 3

genom: jednlonačna kružna +DNA; 6,4 kb; 11 gena i IGR (intergena regija: odgovorna za replikaciju i pakiranje DNA)

Question 4

objasni kako filamentozni jednolančani DNA virusi inficiraju stanicu

Answer 4

(1) inficiraju stanicu preko pilusa (zato se koristi bakterija genotipa npr: F’[proAB+] ΔproAB)
(2) +lanac DNA ulazi u stanicu
(3) na DNA se vežu SSB proteini te počinje sinteza -lanca DNA (RNA-klica) u IGR
(4) dvolančana DNA nastala sintezom -lanca se transkribira te nastaju virusni proteini; protein gp2 uvodi jednolančani lom (“nikira”) +lanac u IGR
(5) replikacija “kotrljajućim krugom”; protein gp2 cijepa jednolančanu DNA u IGR
(6) protein gp2 ligira jednolančane fragmente DNA te nastaje kružna jednolančana +DNA
(7) pakiranje se odvija na površini stanice bez liziranja (tijekom jedne generacije iz jedna bakterijske stanice oslobodi se ~1000 virusnih čestica)

Question 5

kako izoliramo fagmide u jednolančanom obliku

Answer 5

fagmid je plazmid koji sadrži IGR iz jednolančanih DNA virusa (f1-regija, f1-ori)
u dvolančanom obliku, fagmid se može izolirati iz bilo kojeg soja E. coli
plazmid (fagmid) kojeg želimo izolirati u jednolančanom obliku mora se nalaziti u F+, F’ ili Hfr soju E. coli
bakterije E.coli koje sadrže plazmid (fagmid) inficiraju se “helper”- fagom - filamentozni jednolančani DNA virus koji je genetički modificiran - ima smanjenu uspješnost replikacije i pakiranja zbog mutacije u IG-regiji – zbog toga se, u virusne čestice znatno češće pakira fagmid nego genom „helpera”
jednolančani fagmid izolira se centrifugiranjem suspenzije E.coli koja je inficirana „helper”- fagom - virusne čestice ostaju u supernatantu i iz njih se izolira jednolančani fagmid i mali udio genoma „helpera”

Question 6

što je helper-fag

Answer 6

to je jednolančani filamentozni fag koji ima mutaciju u IGR regiji tako da se njegov genom manje efikasno replicira i ugrađuje u virusne čestice

Question 7

što je BAC

Answer 7

BAC – “Bacterial Artificial Chromosome”
- osnova je F-faktor E. coli
- ishodište replikacije
- sekvencije odgovorne za pravilnu segregaciju
- rezistencija na antibiotik
- cos, loxP…; promotori, terminatori, MCS …
- kloniranje u lacZ ili sucB
* lacZ – “plavo-bijelo”
* sucB – gen iz Bacillus amyloliquefaciens; kodira za enzim koji hidrolizira saharozu i sintetizira polisaharid levan, a on je toksičan za E. coli

Question 8

što je YAC

Answer 8

Yeast artificial chromosome - umjetni kvaščev kromosom

Question 9

koje regije ima YAC

Answer 9

ori i bla – replikacija i selekcija u E. coli
ARS – ishodište replikacije u S. cerevisiae
CEN4 – centromera iz S. cerevisiae
TEL – telomera iz S. cerevisiae
URA3, TRP1 i HIS4 (auksotrofni biljezi) - kvaščevi geni potrebni za sintezu uracila, triptofana i histidina
MCS – polilinker unutar gena SUP4 (MCS ne uzrokuje inaktivaciju gena SUP4)
SUP4 – kodira za tRNATyr koja suprimira mutaciju (pojavu STOP kodona) u genu ade2

Question 10

kakve su boje stanice kvasca ako je SUP4 aktivan, a kakve ako je inaktivan

Answer 10

Ako je SUP4 funkcionalan kolonije kvasca ade2 kvasca su –> bijele boje
Ako je SUP4 nefunkcionalan kolonije ade2 su –> crvene boje (u orfu gena ade2 se prerano pojavljuje stop-kodon)
dolazi do intergenske, direktne, informacijske supresije mutacija

Question 11

kako se klonira u YAC-ovima

Answer 11

1. Restrikcija - izrezivanje HIS4 (da bi se telomere nalazile na kraju kromosoma) i cijepanje u MCS
2. Preparativna elektroforeza - izolacija dva fragmenta kromosoma i uklanjanje HIS4
3. Ligiranje dva fragmenta kromosoma i inserata (fragmenata genoma)
4. Transformacija kvasca ligacijskom otopinom - genotip kvasca: Δura3 Δtrp1 ade2 Δhis4 (fenotip: Ura- Trp- Ade- His-)
5. Selekcija transformanata - podloga bez uracila i triptofana (fenotip transformanata: Ura+ Trp+)
   * transformanti sigurno sadrže obje ruke kromosoma (fragmenta)
   * provjera na podlozi bez histidina

Question 12

kakve su bijele kolonije

Answer 12

imaju aktivan SUP4 - YAC ne sadrži insert

Question 13

kakve su crvene kolonije

Answer 13

imaju inaktivan SUP4 - YAC sadrži insert

Question 14

koja je upotreba ekspresijskih vektora

Answer 14

ekspresija klonirane DNA i dobivanje velike količine genskog produkta (mRNA i/ili proteina ili odgovarajućeg metabolita)
biokemija – istraživanje svojstava proteina
biotehnologija – proizvodnja odgovarajućeg proteina ili nekog metabolita

Question 15

objasni ekspresijske vektore

Answer 15

klonirana DNA stavlja se pod regulaciju viralnih, bakterijskih animalnih i biljnih promotora
promotori se mogu nalaziti sa obje strane MCS-a tako da se može transkribirati jedan ili drugi lanac kloniranog fragmenta

Question 16

objasni ekspresiju in vivo kod eksp. vektora

Answer 16

za ekspresiju in vivo konstruirani su i bakterijski sojevi koji eksprimiraju viralne RNA-polimeraze (pogodni su inducibilni promotori):
sintetski trc promotor (trp + lac) – indukcija IPTG-om
PL promotor bakteriofaga lambda pod kontrolom represora cI koji je pod kontrolom trp promotora – dodatkom triptofana reprimira se sinteza cI represora – indukcija ekspresije kloniranog gena
promotor operona araBAD – ekspresija regulirana udjelom glukoze i arabinoze u podlozi

Question 17

što je his-tag

Answer 17

histidinska oznaka (dodatak) - dodaje se 6 (do 10) histidina na N- ili C-kraj eksprimiranog proteina
olakšava izolaciju i pročišćavanje (purifikaciju) proteina (afinitetna kromatografija, reverzibilna interakcija s dvovalentnim metalnim ionima, Ni2+)
može sadržavati i mjesto za proteolitičko cijepanje što omogućava uklanjanje oznake (“his-tag”) s izoliranog proteina
izolira se na kolonama, a može se naknadno ukloniti enzimima

Question 18

gdje se ubacuje his-tag sekvenca

Answer 18

sekvencija koja kodira za “his-tag” – “in frame”, neposredno iza START kodona ili
neposredno prije STOP kodona - može biti sastavni dio ekspresijskog vektora ili se može dodati pomoću PCR-a

Question 19

navedi ostala svojstva ekspresijskih vektora

Answer 19

1. set od tri vektora u kojima je restrikcijsko mjesto za kloniranje pomaknuto za po
   jedan pb - omogućava kloniranje fragmenta u tri različita okvira čitanja
2. sadrže terminatore, sekvencije koje omogućavaju izlučivanje (sekreciju) proteina izvan stanice, sekvencije koje pospješuju topivost proteina
3. posebni vektori koji omogućuju kloniranje rekombinacijom in vitro mogu sadržavati sekvencije:
   - att koju prepoznaje integraza bakteriofaga lambda
   - FRT koju prepoznaje rekombnaza Flp iz kvasca
   - loxP koju prepoznaje rekombinaza Cre iz bakteriofaga P1
4. kloniranje mjesno-specifičnom rekombinacijom in vitro