Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

geneticko inz 2 parc > metode za analizu polimorfizana DNA > Flashcards

metode za analizu polimorfizana DNA Flashcards

1
Q

što znače kratice RFLP, RAPD, FISH i VNTR

A

RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphism - Polimorfizam veličine restrikcijskih fragmenta
RAPD - “Randomly Amplyfied Polymorphic DNA - Analiza slučajnim umnaženjem polimorfne DNA
FISH - “Fluorescent In Situ Hybridization - Fluorescentna in situ hibridizacija
VNTR - Variable Number of Tandem Repeats - Polimorfizam broja uzastopno ponovljenih sekvencija

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

što znače kratice fAFLP, SSCP i DGGE

A

fAFLP - “fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfizam duljine umnoženih fluorescentnih fragmenata
SSCP - “Single Strand Conformation Polymorphism - Analiza polimorfizma konformaciije jednolančane DNA
DGGE - “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis” - Elektroforeza u gradijentu denaturirajućeg agensa ili gradijentu temperature

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

koje su sekvencije (dijelovi genoma) pogodni za genetičku analizu

A

cjelokupni genom
mitohondrijska DNA
ponovljene sekvencije - varijabilnost broja i divergencija ponovljenih kopija (one se vrlo često analiziraju)
specifični geni ili sekvencije (najčešće umnožene pomoću PCR-a)
rDNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

objasni rDNA

A

dio DNA koji kodira za rRNA (rRNA-geni), nalazi se u stanicama svih organizama
najčešće korištena sekvencija za genotipizaciju
sadrži i jako sačuvane (konzervirane) i varijabilne regije
nalazi se u genomima svih organizama - prokarioti - jedna ili više kopija (sedam u E. coli); eukarioti - često više stotina uzastopno istosmjerno ponovljenih kopija

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

koja je razlika rDNA u prokariota i eukariota

A

prokarioti - jedan transkript, procesiranje
eukarioti (dva transkripta), procesiranje
- jedan transkript - 28S, 18S i 5,8S – RNA-polimeraza I
- drugi transkript - 5S rRNA – RNA-polimeraza III

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

što su ETR i ITS regije kod pre-rRNA

A

ETR (“external transcribed region”) i ITS (“internal transcribed spacer”) - ne ulaze u sastav rRNA i ribosoma (“nekodirajući”) i to su varijabilne regije (razlikovanje filogenetski bliskih organizama)
dijelovi koji čine rRNA i ulaze u sastav ribosoma (sive regije na slici) - tijekom evolucije se sporo mijenjaju (sačuvani, konzervirani) i omogućuju razlikovanje filogenetski udaljenih organizama

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

kako se dijele ponovljene sekvence

A

“razbacane” ili “disperzne” ponovljene sekvencije - razbacana ili disperzna ponavljanja
uzastopno ponovljene sekvencije (uzastopna ponavljanja) - direktna (istosmjerna) ponavljanja; obrnuta (invertna) ponavljanja; (sa ili bez “spacera”, odjeljujuće sekvencije)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

objasni princip RFLP-a

A
  1. priprema DNA - izolacija DNA ili PCR-om
  2. cijepanje s jednim ili više restrikcijskih enzima - provodi se restrikcija
  3. gel-elektroforeza (agarozna, poliakrilamidna ili pulsirajuća) - ovisno o veličini fragmenata DNA
  4. vizualizacija vrpci - može biti etidij-bromidom ili hibridizacijom (komplementarnim sparivanjem) s označenom/obilježenom DNA (sonda/proba) - southern blot
    - neki gen, neka ponovljena sekvencija (satelitna DNA, transpozon….)
    - rDNA – “ribotyping”
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

koje mutacije se mogu detektirati pomoću RFLP-a

A

točkaste mutacije (insercije, delecije, supstitucije)
velike insercije i delecije
inverzije i translokacije

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

objasni RAPD-PCR

A

“Randomly Amplyfied Polymorphic DNA”
analiza slučajnim umnažanjem polimorfne DNA
PCR se provodi u uvjetima u kojima nastaje više vrpci
brza i jeftina metoda; problem - interlaboratorijska reproducibilnost

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

što je VNTR metoda

A

promjenjivi broj uzastopnih ponavljanja
primjer analize hipervarijabilnog lokusa D1S (minisatelit - sekvenca se puno puta istosmjerno ponavlja)
D1S se nalazi u blizini drugog lokusa koji nije hipervarijabilni; ima dvije uzastopno ponovljene sekvence A i T koje su iste samo se razlikuju u drugom nukleotidu i u zadnjem nukleotidu
potrebne su 4 početnice - 32-TAG-A, 32-TAG-T, TAG i 32D (komplementarna je drugom lokusu)
koristi se za utvrđivanje očinstva, određivanje identiteta

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

objasni postupak VNTR metode

A
  1. potrebno izolirati DNA
  2. sinteza DNA u dvije reakcijske otopine
    • A: početnica je 32-TAG-A (sinteza iz A prema D1S8) - u jednoj otopini
    • T: početnica je 32-TAG-T (sinteza iz T prema D1S8) - u drugoj otopini
      TAG-A se komplementarno sparuje sa sekvencom A
  3. nakon sinteze jednolančane DNA dodaje se početnica za nevarijabilni dio, D1S8, te se dobije dvolančana DNA
  4. nakon toga se dodaje TAG-primer (veže se na dio 32-TAG-a koji strši) i radi se PCR
  5. provodi se gel elektroforeza i na gelu se vide samo A sekvence ili T sekvence
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

objasni princip AFLP i fAFLP metode

A
  1. izolira se DNA iz mikroorganizma
  2. ta se DNA pocijepa s dva restrikcijska enzima (EcoRI i MseI)
  3. nastaje puno fragmenata te cijepanjem nastaju 3 vrste fragmenata (koji su s obje strane pocijepani s EcoRI ili s MselI ili su s jedne strane pocijepani s jednim, a s druge s drugim enzimom)
  4. u pocijepanu DNA se dodaje adaptori koji su komplementarni s krajem koji nastaje cijepanjem
  5. ligiraju se fragmenti i DNA i dobiju se opet 3 vrste fragmenata
  6. provodi se PCR s preselektivnim početnicama i umnažaju se samo fragmenti koji imaju različite adaptere na krajevima jer se oni neće međusobno spojiti
  7. ponovno se provodi PCR ali sa selektivnim početnicama koje su obilježene (radioaktivno ili fluorescentno)
  8. dobiju se ponovno E-M fragmenti
  9. provodi se denaturirajuća elektroforeza jer želimo vidjeti jednolančane DNA
  10. zadnji korak je detekcija - AFLP - autoradiografija ili fAFLP - fluorescencija
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

što su to preselektivne početnice

A

početnice koje su od svog 5’-kraja potpuno komplementarne s DNA i imaju višak jednog nukleotida na 3’-kraju

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

što su to selektivne početnice

A

na 3’-kraju se dodaju još dva nukelotida

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

što je SSCP metoda

A

Princip - elektroforeza jednolančane DNA u nedenaturirajućim uvjetima
- DNA iste duljine ali različitog redosljeda nukleotida stvara različite sekundarne strukture koje utječu na brzinu migracije
provodi se u denaturirajućim uvjetima zato da DNA dobije određenu trodimenzionalnu strukturu i kad se radi elektroforeza imamo razdvajanje ne po veličini već po trodim. strukturi

17
Q

objasni postupak SSCP metode

A
  1. priprema ssDNA - umnažanje pomoću PCR (u prisutnosti radioaktivnog nukleotida) pa denaturacija DNA i naglo hlađenje (da se jednolančane DNA intralančano spoje) ili asimetrični PCR – veliki suvišak jedne početnice (u početku nastaju dvolančane DNA i kad se jedna početnica potroši dolazi do umnažanja jednolančane DNA na koju se veže početnica u suvišku)
  2. elektroforeza u poliakrilamidnom gelu pri nedenaturirajućim uvjetima
  3. autoradiografija (nije potrebno ako ima puno DNA)
18
Q

što je DGGE/TGGE metoda

A

princip
- ektroforeza dvolančane DNA u gradientu denaturirajučeg agensa
- koncentracija denaturirajućeg agensa raste u smjeru migracije DNA (od gore prema dolje)
- dsDNA iste duljine, zbog razlike u AT/GC-sastavu i redoslijedu nukleotida, počinje se denaturirati na različitim mjestima u gelu (ne dolazi do trenutne denaturacije nego postepeno)
- brže će se denaturirati DNA koja ima manji GC-sastav
- djelomična (lokalna) denaturacija usporava migraciju dsDNA

19
Q

objasni postupak DGGE metode

A

fragmenti DNA su umnoženi PCR-om i dodane su im GC-bogate regije kako bi se spriječila potpuna denaturacija
na gelu onaj najviši bend je najbrže denaturirao (kako DNA denaturira tako se prije zaustavlja u gelu jer zauzima više mjesta) i ima najmanji GC-sastav
onaj najniži bend ima najveći GC-sastav pa je i najsporije denaturirao i najbrže migrirao

20
Q

objasni postupak analize heterodupleksne DNA

A
  1. PCR - umnažaju se zdrave i tumorske DNA (imaju mutaciju)
  2. denaturacija - umnožene DNA se denaturiraju da se dobiju jednolančane DNA
  3. renaturacija - postepenim hlađenjem se međusobno spare komplementarni lanci (mogu se dobiti 4 različite dvolanč. DNA)
  4. analiza - elektroforeza, detekcija nesparenih baza ili sekvencioniranje
21
Q

što je FISH metoda

A

metafazni kromosomi hibridiziraju se s fluorescentnim probama
koristi se za detekciju kromosomskih mutacija, u prenatalnoj dijagnostici, kod analize kariotipa

22
Q

objasni prvi način genotipizacije bakterije

A
  1. kolonije se uzgajaju na podlozi i izolira se DNA te se restrikcijskim enzimom pocijepa
  2. provodi se agarozna nedenaturirajuća elektroforeza - fragmenti se razdvajaju po veličini
  3. svi ti fragmenti se preslikaju na membranu
  4. onda se hibridiziraju sondom koja je obilježena
  5. vizualiziraju se samo oni fragmenti koji imaju IS-sekvencu (na njih je vezana sonda)
23
Q

objasni drugi način genotipizacije bakterije

A
  1. Miru sekvence se umnože PCR-om
  2. provede se gel elektroforeza, standard su fragmenti koji odgovaraju duljinom jednoj ponovljenoj sekvenci, dvije ponovljene sekvence…
    npr. fragment A ima 5 ponavljanja i na gelu se nalazi na mjestu 5 odozdola
24
Q

što je to sekvencioniranje DNA

A

osniva se na mogućnosti razdvajanja obilježenih polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid - elektroforeza u poliakrilamidnom gelu

25
Q

kako se priprema DNA prije sekvencioniranja

A

priprema DNA prije elektroforeze - provode se četiri reakcije specifične za svaku pojedinu bazu
- u jednoj reakciji nastaju polinukleotidni lanci koji završavaju citozinom, u drugoj gvaninom, trećoj adeninom, a četvrtoj timinom

26
Q

koje se dvije metode koriste za sekvencioniranje DNA

A

kemijska metoda (Maxam-Gilbert) – specifično kemijsko cijepanje DNA
dideoksi-metoda (Sanger) – prekid sinteze DNA na jednoj od baza

27
Q

kakva je uspješnost reakcije i kako se vizualizira kod sekvencioniranja DNA

A

Uspješnost reakcije ne smije biti 100 % (jer će se samo cijela DNA narezati na male komadiće) - lom (kemijska metoda) ili prekid sinteze (dideoksi-metoda) događa se s određenom vjerojatnošću (~1%- tako da se dobiju fragmenti različitih duljina koji završavaju na određene nukleotode)
vizualizacija DNA - autoradiografija ili fluorescencija

28
Q

što je Sangerova, dideoksi metoda

A

osniva se na sintezi komplementarnog lanca DNA u prisustvu 2’,3’-dideoksi nukleotida (ddNTP)
ugradnja dideoksi nukleotida uzrokuje prekid sinteze DNA - na primjer, u prisustvu ddATP sinteza se prekida nasuprot timina
- uz dideoksinukleotid (npr ddATP) u smjesi za sintezu mora se nalaziti i odgovarajući deoksinukleotid (dATP) zbog toga da se sinteza svih lanaca ne bi zaustavila već nasuprot prvog timina
- omjer deoksi- i dideoksinukleotida je takav da je vjerojatnost ugradnje dideoksi nukleotida ~1/100

29
Q

što je ddNTP

A

nukleotid koji ne sadrži OH-skupinu ni na 2’C ni na 3’C-atomu i njegova ugradnja rezultira prekidom sinteze DNA jer nema slobodnih OH-skupina

30
Q

kakav je sastav reakcijske otopine za sekvencioniranje

A

DNA koja se sekvencionira (ssDNA ili denaturirana dsDNA) – kalup
klica – oligonukleotid od kojeg započinje sinteza
DNA-polimeraza
pufer (Mg2+, NaCl, pH…)
deoksiribonukleotidi i dideoksiribonukleotid
radioaktivno obilježavanje: klica
fluorescentno obilježavanje: klica ili ddNTP
sinteza DNA se provodi u 4 odvojene reakcije (tubice)

31
Q

kakva je elektroforeza za sekvencioniranje

A

razdvajanje polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid
- provodi se u denaturirajućim uvjetima
- poliakrilamidni gel (6 do 8 %)
- 7 M urea
- napon: 1500 do 1700 V
- temperatura: 65ºC

32
Q

objasni automatizirano sekvencioniranje

A

elektroforeza u kapilari
koriste se fluorescentni dideoksinukleotidi
gleda se pobuđivanje i očitavanje fluorescencije

geneticko inz 2 parc (7 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions