metode za analizu polimorfizana DNA Flashcards
što znače kratice RFLP, RAPD, FISH i VNTR
RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphism - Polimorfizam veličine restrikcijskih fragmenta
RAPD - “Randomly Amplyfied Polymorphic DNA - Analiza slučajnim umnaženjem polimorfne DNA
FISH - “Fluorescent In Situ Hybridization - Fluorescentna in situ hibridizacija
VNTR - Variable Number of Tandem Repeats - Polimorfizam broja uzastopno ponovljenih sekvencija
što znače kratice fAFLP, SSCP i DGGE
fAFLP - “fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfizam duljine umnoženih fluorescentnih fragmenata
SSCP - “Single Strand Conformation Polymorphism - Analiza polimorfizma konformaciije jednolančane DNA
DGGE - “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis” - Elektroforeza u gradijentu denaturirajućeg agensa ili gradijentu temperature
koje su sekvencije (dijelovi genoma) pogodni za genetičku analizu
cjelokupni genom
mitohondrijska DNA
ponovljene sekvencije - varijabilnost broja i divergencija ponovljenih kopija (one se vrlo često analiziraju)
specifični geni ili sekvencije (najčešće umnožene pomoću PCR-a)
rDNA
objasni rDNA
dio DNA koji kodira za rRNA (rRNA-geni), nalazi se u stanicama svih organizama
najčešće korištena sekvencija za genotipizaciju
sadrži i jako sačuvane (konzervirane) i varijabilne regije
nalazi se u genomima svih organizama - prokarioti - jedna ili više kopija (sedam u E. coli); eukarioti - često više stotina uzastopno istosmjerno ponovljenih kopija
koja je razlika rDNA u prokariota i eukariota
prokarioti - jedan transkript, procesiranje
eukarioti (dva transkripta), procesiranje
- jedan transkript - 28S, 18S i 5,8S – RNA-polimeraza I
- drugi transkript - 5S rRNA – RNA-polimeraza III
što su ETR i ITS regije kod pre-rRNA
ETR (“external transcribed region”) i ITS (“internal transcribed spacer”) - ne ulaze u sastav rRNA i ribosoma (“nekodirajući”) i to su varijabilne regije (razlikovanje filogenetski bliskih organizama)
dijelovi koji čine rRNA i ulaze u sastav ribosoma (sive regije na slici) - tijekom evolucije se sporo mijenjaju (sačuvani, konzervirani) i omogućuju razlikovanje filogenetski udaljenih organizama
kako se dijele ponovljene sekvence
“razbacane” ili “disperzne” ponovljene sekvencije - razbacana ili disperzna ponavljanja
uzastopno ponovljene sekvencije (uzastopna ponavljanja) - direktna (istosmjerna) ponavljanja; obrnuta (invertna) ponavljanja; (sa ili bez “spacera”, odjeljujuće sekvencije)
objasni princip RFLP-a
- priprema DNA - izolacija DNA ili PCR-om
- cijepanje s jednim ili više restrikcijskih enzima - provodi se restrikcija
- gel-elektroforeza (agarozna, poliakrilamidna ili pulsirajuća) - ovisno o veličini fragmenata DNA
- vizualizacija vrpci - može biti etidij-bromidom ili hibridizacijom (komplementarnim sparivanjem) s označenom/obilježenom DNA (sonda/proba) - southern blot
- neki gen, neka ponovljena sekvencija (satelitna DNA, transpozon….)
- rDNA – “ribotyping”
koje mutacije se mogu detektirati pomoću RFLP-a
točkaste mutacije (insercije, delecije, supstitucije)
velike insercije i delecije
inverzije i translokacije
objasni RAPD-PCR
“Randomly Amplyfied Polymorphic DNA”
analiza slučajnim umnažanjem polimorfne DNA
PCR se provodi u uvjetima u kojima nastaje više vrpci
brza i jeftina metoda; problem - interlaboratorijska reproducibilnost
što je VNTR metoda
promjenjivi broj uzastopnih ponavljanja
primjer analize hipervarijabilnog lokusa D1S (minisatelit - sekvenca se puno puta istosmjerno ponavlja)
D1S se nalazi u blizini drugog lokusa koji nije hipervarijabilni; ima dvije uzastopno ponovljene sekvence A i T koje su iste samo se razlikuju u drugom nukleotidu i u zadnjem nukleotidu
potrebne su 4 početnice - 32-TAG-A, 32-TAG-T, TAG i 32D (komplementarna je drugom lokusu)
koristi se za utvrđivanje očinstva, određivanje identiteta
objasni postupak VNTR metode
- potrebno izolirati DNA
- sinteza DNA u dvije reakcijske otopine
- A: početnica je 32-TAG-A (sinteza iz A prema D1S8) - u jednoj otopini
- T: početnica je 32-TAG-T (sinteza iz T prema D1S8) - u drugoj otopini
TAG-A se komplementarno sparuje sa sekvencom A
- nakon sinteze jednolančane DNA dodaje se početnica za nevarijabilni dio, D1S8, te se dobije dvolančana DNA
- nakon toga se dodaje TAG-primer (veže se na dio 32-TAG-a koji strši) i radi se PCR
- provodi se gel elektroforeza i na gelu se vide samo A sekvence ili T sekvence
objasni princip AFLP i fAFLP metode
- izolira se DNA iz mikroorganizma
- ta se DNA pocijepa s dva restrikcijska enzima (EcoRI i MseI)
- nastaje puno fragmenata te cijepanjem nastaju 3 vrste fragmenata (koji su s obje strane pocijepani s EcoRI ili s MselI ili su s jedne strane pocijepani s jednim, a s druge s drugim enzimom)
- u pocijepanu DNA se dodaje adaptori koji su komplementarni s krajem koji nastaje cijepanjem
- ligiraju se fragmenti i DNA i dobiju se opet 3 vrste fragmenata
- provodi se PCR s preselektivnim početnicama i umnažaju se samo fragmenti koji imaju različite adaptere na krajevima jer se oni neće međusobno spojiti
- ponovno se provodi PCR ali sa selektivnim početnicama koje su obilježene (radioaktivno ili fluorescentno)
- dobiju se ponovno E-M fragmenti
- provodi se denaturirajuća elektroforeza jer želimo vidjeti jednolančane DNA
- zadnji korak je detekcija - AFLP - autoradiografija ili fAFLP - fluorescencija
što su to preselektivne početnice
početnice koje su od svog 5’-kraja potpuno komplementarne s DNA i imaju višak jednog nukleotida na 3’-kraju
što su to selektivne početnice
na 3’-kraju se dodaju još dva nukelotida
što je SSCP metoda
Princip - elektroforeza jednolančane DNA u nedenaturirajućim uvjetima
- DNA iste duljine ali različitog redosljeda nukleotida stvara različite sekundarne strukture koje utječu na brzinu migracije
provodi se u denaturirajućim uvjetima zato da DNA dobije određenu trodimenzionalnu strukturu i kad se radi elektroforeza imamo razdvajanje ne po veličini već po trodim. strukturi
objasni postupak SSCP metode
- priprema ssDNA - umnažanje pomoću PCR (u prisutnosti radioaktivnog nukleotida) pa denaturacija DNA i naglo hlađenje (da se jednolančane DNA intralančano spoje) ili asimetrični PCR – veliki suvišak jedne početnice (u početku nastaju dvolančane DNA i kad se jedna početnica potroši dolazi do umnažanja jednolančane DNA na koju se veže početnica u suvišku)
- elektroforeza u poliakrilamidnom gelu pri nedenaturirajućim uvjetima
- autoradiografija (nije potrebno ako ima puno DNA)
što je DGGE/TGGE metoda
princip
- ektroforeza dvolančane DNA u gradientu denaturirajučeg agensa
- koncentracija denaturirajućeg agensa raste u smjeru migracije DNA (od gore prema dolje)
- dsDNA iste duljine, zbog razlike u AT/GC-sastavu i redoslijedu nukleotida, počinje se denaturirati na različitim mjestima u gelu (ne dolazi do trenutne denaturacije nego postepeno)
- brže će se denaturirati DNA koja ima manji GC-sastav
- djelomična (lokalna) denaturacija usporava migraciju dsDNA
objasni postupak DGGE metode
fragmenti DNA su umnoženi PCR-om i dodane su im GC-bogate regije kako bi se spriječila potpuna denaturacija
na gelu onaj najviši bend je najbrže denaturirao (kako DNA denaturira tako se prije zaustavlja u gelu jer zauzima više mjesta) i ima najmanji GC-sastav
onaj najniži bend ima najveći GC-sastav pa je i najsporije denaturirao i najbrže migrirao
objasni postupak analize heterodupleksne DNA
- PCR - umnažaju se zdrave i tumorske DNA (imaju mutaciju)
- denaturacija - umnožene DNA se denaturiraju da se dobiju jednolančane DNA
- renaturacija - postepenim hlađenjem se međusobno spare komplementarni lanci (mogu se dobiti 4 različite dvolanč. DNA)
- analiza - elektroforeza, detekcija nesparenih baza ili sekvencioniranje
što je FISH metoda
metafazni kromosomi hibridiziraju se s fluorescentnim probama
koristi se za detekciju kromosomskih mutacija, u prenatalnoj dijagnostici, kod analize kariotipa
objasni prvi način genotipizacije bakterije
- kolonije se uzgajaju na podlozi i izolira se DNA te se restrikcijskim enzimom pocijepa
- provodi se agarozna nedenaturirajuća elektroforeza - fragmenti se razdvajaju po veličini
- svi ti fragmenti se preslikaju na membranu
- onda se hibridiziraju sondom koja je obilježena
- vizualiziraju se samo oni fragmenti koji imaju IS-sekvencu (na njih je vezana sonda)
objasni drugi način genotipizacije bakterije
- Miru sekvence se umnože PCR-om
- provede se gel elektroforeza, standard su fragmenti koji odgovaraju duljinom jednoj ponovljenoj sekvenci, dvije ponovljene sekvence…
npr. fragment A ima 5 ponavljanja i na gelu se nalazi na mjestu 5 odozdola
što je to sekvencioniranje DNA
osniva se na mogućnosti razdvajanja obilježenih polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid - elektroforeza u poliakrilamidnom gelu
kako se priprema DNA prije sekvencioniranja
priprema DNA prije elektroforeze - provode se četiri reakcije specifične za svaku pojedinu bazu
- u jednoj reakciji nastaju polinukleotidni lanci koji završavaju citozinom, u drugoj gvaninom, trećoj adeninom, a četvrtoj timinom
koje se dvije metode koriste za sekvencioniranje DNA
kemijska metoda (Maxam-Gilbert) – specifično kemijsko cijepanje DNA
dideoksi-metoda (Sanger) – prekid sinteze DNA na jednoj od baza
kakva je uspješnost reakcije i kako se vizualizira kod sekvencioniranja DNA
Uspješnost reakcije ne smije biti 100 % (jer će se samo cijela DNA narezati na male komadiće) - lom (kemijska metoda) ili prekid sinteze (dideoksi-metoda) događa se s određenom vjerojatnošću (~1%- tako da se dobiju fragmenti različitih duljina koji završavaju na određene nukleotode)
vizualizacija DNA - autoradiografija ili fluorescencija
što je Sangerova, dideoksi metoda
osniva se na sintezi komplementarnog lanca DNA u prisustvu 2’,3’-dideoksi nukleotida (ddNTP)
ugradnja dideoksi nukleotida uzrokuje prekid sinteze DNA - na primjer, u prisustvu ddATP sinteza se prekida nasuprot timina
- uz dideoksinukleotid (npr ddATP) u smjesi za sintezu mora se nalaziti i odgovarajući deoksinukleotid (dATP) zbog toga da se sinteza svih lanaca ne bi zaustavila već nasuprot prvog timina
- omjer deoksi- i dideoksinukleotida je takav da je vjerojatnost ugradnje dideoksi nukleotida ~1/100
što je ddNTP
nukleotid koji ne sadrži OH-skupinu ni na 2’C ni na 3’C-atomu i njegova ugradnja rezultira prekidom sinteze DNA jer nema slobodnih OH-skupina
kakav je sastav reakcijske otopine za sekvencioniranje
DNA koja se sekvencionira (ssDNA ili denaturirana dsDNA) – kalup
klica – oligonukleotid od kojeg započinje sinteza
DNA-polimeraza
pufer (Mg2+, NaCl, pH…)
deoksiribonukleotidi i dideoksiribonukleotid
radioaktivno obilježavanje: klica
fluorescentno obilježavanje: klica ili ddNTP
sinteza DNA se provodi u 4 odvojene reakcije (tubice)
kakva je elektroforeza za sekvencioniranje
razdvajanje polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid
- provodi se u denaturirajućim uvjetima
- poliakrilamidni gel (6 do 8 %)
- 7 M urea
- napon: 1500 do 1700 V
- temperatura: 65ºC
objasni automatizirano sekvencioniranje
elektroforeza u kapilari
koriste se fluorescentni dideoksinukleotidi
gleda se pobuđivanje i očitavanje fluorescencije
