metode pretraživanja i obilježavanja Flashcards
što je pokrivenost banke gena
odnos (omjer) ukupne količine klonirane DNA (duljine, pb) sadržane u genomskoj banci i veličine genoma (pb) odgovarajućeg organizma
pobliže objasni pokrivenost banke gena
banka gena je kvalitetnija što je “pokrivenost banke” veća - pokrivenost 3,8 puta – količina DNA (inserata) koja je pohranjena genomskoj banci je 3,8 puta veća od duljine genoma odgovarajućeg organizma – pokrivenost je 380 %
veća “pokrivenost” – veća vjerojatnost da banka sadrži sve dijelove (fragmente, gene) odgovarajućeg genoma
koji su podaci potrebni za računanje pokrivenosti
veličina genoma organizma čiju genomsku banku radimo
strategija: vektor i domaćin (duljina inserta u pojedinačnim klonovima)
vjerojatnost da banka sadrži sve fragmente genoma
broj klonova
koja je formula za izračun broja klonova
N = ln(1-P) / ln(1-F)
P – prosječan udio genoma u jednom klonu
F = (prosječna duljina inserta u vektoru) / (duljina genoma)
čemu služi banka gena
za sekvencioniranje cijelih genoma / meta genoma i pronalaženje nekog gena ili sekvencije
zašto se pretražuju banke gena
identifikacija, pronalaženje jednog ili više željenih klonova u banci gena
svrha: fundamentalna i primijenjena istraživanja
- pronalaženja točno određenog gena, dijela gena koji kodira za neku proteinsku domenu ili neke nekodirajuće DNA (ARS, CEN, neki određeni promotor, terminator, konsenzus sekvencije . . .)
- pronalaženje gena, proteina koji ima određenu enzimsku aktivnost ili karakterističnu domenu (lipaze, esteraze, fosfataze, kinaze . . .)
- pronalaženje gena koji može komplementirati neku mutaciju
- pronalaženje potpuno novih (nepoznatih) gena i proteina, istraživanje njihovih karakteristika i bioloških uloga
nabroji strategije za pretraživanje banke gena
Komplementacija mutacije
Umnažanje željene DNA pomoću PCR-a
Imunološka detekcija
Hibridizacijske metode (komplementarno sparivanja)
što je komplementacija mutacija
traženi gen komplementira mutaciju (najjednostavnije za biosintetske putove)
transformirane stanice koje sadrže traženi gen rastu na selektivnoj podlozi
neophodno je da se gen eksprimira u stanici domaćinu
moguće za relativno mali broj gena
što je umnažanje željene DNA pomoću PCR-a
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
za samo pretraživanje nije potrebna ekspresija gena
što je imunološka detekcija
vizualizacija koja se osniva na vezanju specifičnih obilježenih protutijela na željeni protein (antigenu determinantu) – ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
neophodna ekspresija gena
što su hibridizacijske metode
postojanje traženog gena se vizualizira komplementarnim sparivanjem s obilježenom DNA (proba, sonda)
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
nije potrebna ekspresija gena
objasni pretraživanje komplementacijom
- uzme se genom S. cerevisiae koji je Leu+ (može sam sebi sintetizirati leucin) i taj se genom fragmentira
- ti se fragmenti pomiješaju s plazmidom koji je lineariziran
- radi se ligacija plazimida i fragmenata te nastaju kružni vektori koji sadrže fragmente genoma kvasca
- transformiraju se E. coli koje su leu- (imaju mutaciju u LeuB) i transformirane stanice nacjepljujemo na podlogu bez leucina
- izrastu samo one kolonije koje imaju plazmid s genom Leu+
- izdvojimo porasle stanice na podlozi bez leucina i uzgojimo ih do većeg broja te izoliramo plazmid
- transformiramo stanice kvasca koje su leu- s tim plazmidom koji je Leu+ i dolazi do komplementacije mutacije i sada sve stanice rastu na podlozi bez leucina
objasni pretraživanje pomoću PCR-a
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
u genomskoj banci potrebno je pronaći klon koji sadrži traženu sekvenciju/gena
kao kalup za PCR najprije se koriste skupine združenih klonova (10 po 10 uzoraka koji sadrže klonove)
kad se identificira pozitivan uzorak skupina se podijeli u podskupine itd., sve dok se ne pronađe željeni klon
problemi - uspješnost PCR reakcije (lažno negativni rezultati)
- nespecifična sinteza (“parazitske vrpce”) – lažno pozitivni rezultat
objasni imunološko pretraživanje
osniva se na specifičnom vezanju protutijela na protein koji nastaje ekspresijom traženog gena
traženi gen se mora eksprimirati - često je potrebno „prekloniravanje” u drugi vektor i organizam
vizualizacija pomoću obilježenih protutijela - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
koja su dva osnovna pristupa imunološkom pretraživanju
(1) - specifična protutijela su označena radioaktivitetom ili fluorescencijom
(2) - na protutijelo je vezan enzim koji katalizira kolornu reakciju (peroksidaza, alkalna fosfataza…)
objasni ELISA-u
- 1 specifično protutijelo se nalazi na dnu jažice/bunarčića
- protein se specifično veže na 1. protutijelo
- onda se sve ispire tako da ostane samo vezani protein
- zatim se dodaje 2. specifično protutijelo koje se veže s gornje strane na vezani protein i ponovno se ispire
- dodaje se protutijelo za detekciju, ono ima vezani enzim na sebe i dodaje se supstrat koji će se specifično vezati na enzim i dati će neko obojenje kako bi ga mogli detektirati
objasni pretraživanje hibridizacijskim metodama
osniva se na vizualizaciji pozitivnog klona zahvaljujući komplementarnom sparivanju (hibridizaciji) s obilježenom DNA
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
što je obilježena proba (sonda)
nukleinska kiselina (gotovo uvijek DNA) koja sadrži modificirane nukleotide koji omogućavaju njenu vizualizaciju
radioaktivni nukleotidi - vizualizacija autoradiografijom na rendgenskom filmu
fluorescentni nukleotidi - očitavanje odgovarajuće valne duljine
kemijski modificirani nukleotidi (digoksigenin) - vezanje odgovarajućeg protutijela na kojem je vezan enzim
(imunološki pristup)
kako se radioaktivno obilježava DNA i RNA
najčešće korišteni radioaktivni izotopi u biologiji i biokemiji - 25I, 3H, 35S i 32P
nukleinske kiseline obilježavaju se ugradnjom 32P u fosfatnu skupinu ili ili 35S u tiofosfatnu skupinu
za što se koriste radioaktivni nukleotidi
kao prekursori za sintezu polinukleotidnog lanca ([α-32P]dNTP)
kao donori fosfatne skupine tijekom fosforilacije ([γ-32P]ATP)
objasni obilježavanje krajeva mol. NK
koriste se probe niske specifične radioaktivnosti jer su od cijele molekule obilježeni samo krajevi
(1) polimerazna aktivnost - na 3’-uvučenom kraju (npr Klenow fragment)
(2) Taq polimeraza - na ravnom kraju dodaje dATP na 3’-OH
(3) terminalna deoksiribonukleotidil transferaza - dodaje nukleotide na 3’-krajeve jednolančane i dvolančane DNA
(4) polinukleotid fosfataza/kinaza - zamjena fosfatne skupine na 5’-kraju ssDNA, dsDNA, ssRNA
objasni jednoliko obilježavanje mol. NK i nabroji metode
koriste se probe visoke specifične radioaktivnosti jer DNA fragment obilježavamo cijelom duljinom
metode - pomak zareza (”nick translation”), pomak jednolančanog loma
- nasumično započinjanje (“random priming”)
- PCR
- transkripcija in vitro
što je pomak zareza “nick translation”
- imamo linearnu ili kružnu dsDNA
- DNaza I (u prisustvu Ca2+ i Mg2+ uvodi jednolančani lom)
- DNA polimeraza I; jedan od nukleotida je radioaktivan (dATP, dTTP, dCTP ili dGTP) jer
sadrži 35S ili α-32P - koristi svoju 5’-3’ nukleaznu aktivnost - istovremenom degradacijom i sintezom DNA u smjeru 5’-3’ nastaju dugačke obilježene regije
što je nasumično započinjanje -“random priming”
- kalup za sintezu - jednolančana DNA (najčešće kružna) ili dvolančana denaturirana DNA (zagrijana na 95°C i
naglo ohlađena na 4°C) - klica - smjesa svih kombinacija heksa i/ili heptanukleotida (tako da smo sigurni da će se neki od nukleotida kompl. spariti)
- polimeraza - Klenow fragment ili neka druga polimeraza koja nema 5’-3’ egzonukleaznu aktivnost (ne koristi se DNA-pol I jer ona bi skinula početnice i išla stalno u krug); u reakcijskoj otopini, jedan nukleotid je radioaktivan
- nastaje dsDNA u kojoj je jedan lanac obilježen
objasni označavanje pomoću PCR-a
istovremeno umnažanje ciljne sekvencije i ugradnja radioaktivnih nukleotida
gotovo svim molekulama označena su oba lanca - visoka specifičnost
objasni označavanje transkripcijom in vitro
sinteza radioaktivne RNA
ekspresijski vektori - inserti između viralnih promotora (T7, T4. . .)
- moguća transkripcija jednog ili drugog lanca
nakon provedene transkripcije, DNA se degradira pomoću DNaze I
objasni pretraživanje hibridizacijom kolonija
- klonove iz banke gena nacijepimo na podlogu
- nakon što izrastu kolonije, na nitroceluloznu membranu preslikamo kolonije i tu membranu preslikamo na drugu hranjivu podlogu
- stanice kolonija koje su izrasle na membrani liziramo i imamo DNA vezanu na membranu koju onda denaturiramo
- tu membranu stavimo u otopinu u kojoj se nalaze obilježene sonde (radioaktivna DNA) i one se komplementarno sparuju s jednolančanom DNA
- radimo autoradiografiju i ona koja je crna je ona koja sadrži DNA koju smo tražili
- slijedi identifikacija i uzgoj pozitivne kolonije
koji su problemi i rješenja kod hibridizacije kolonija
problemi - zaštita osoblja i okoliša, zahtjevno rukovanje, cijena, administracija
rješenje - upotreba neradioaktivnih proba
što su neradioaktivne probe (sonde)
sonde sadrže kemijski modificirane nukleotide - imaju na sebe vezanu kemijsku skupinu koja djeluje kao antigen
za sintezu neradioaktivnih sondi koriste se iste metode kao i pri sintezi radioaktivnih sondi
kako se detektiraju neradioaktivne sonde
neposredno - fluorescentne probe, sadrže fluorescentne nukleotide
posredno (imunološki) - vezanjem protutijela na antigene koji su vezani na sondu
- antitijelo se može detektirati jer je fluorescentno ili jer se na njega veže enzim koji provodi reakciju koja se može vizualizirati
