Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

geneticko inz 2 parc > metode pretraživanja i obilježavanja > Flashcards

metode pretraživanja i obilježavanja Flashcards

1
Q

što je pokrivenost banke gena

A

odnos (omjer) ukupne količine klonirane DNA (duljine, pb) sadržane u genomskoj banci i veličine genoma (pb) odgovarajućeg organizma

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

pobliže objasni pokrivenost banke gena

A

banka gena je kvalitetnija što je “pokrivenost banke” veća - pokrivenost 3,8 puta – količina DNA (inserata) koja je pohranjena genomskoj banci je 3,8 puta veća od duljine genoma odgovarajućeg organizma – pokrivenost je 380 %
veća “pokrivenost” – veća vjerojatnost da banka sadrži sve dijelove (fragmente, gene) odgovarajućeg genoma

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

koji su podaci potrebni za računanje pokrivenosti

A

veličina genoma organizma čiju genomsku banku radimo
strategija: vektor i domaćin (duljina inserta u pojedinačnim klonovima)
vjerojatnost da banka sadrži sve fragmente genoma
broj klonova

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

koja je formula za izračun broja klonova

A

N = ln(1-P) / ln(1-F)
P – prosječan udio genoma u jednom klonu
F = (prosječna duljina inserta u vektoru) / (duljina genoma)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

čemu služi banka gena

A

za sekvencioniranje cijelih genoma / meta genoma i pronalaženje nekog gena ili sekvencije

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

zašto se pretražuju banke gena

A

identifikacija, pronalaženje jednog ili više željenih klonova u banci gena
svrha: fundamentalna i primijenjena istraživanja
- pronalaženja točno određenog gena, dijela gena koji kodira za neku proteinsku domenu ili neke nekodirajuće DNA (ARS, CEN, neki određeni promotor, terminator, konsenzus sekvencije . . .)
- pronalaženje gena, proteina koji ima određenu enzimsku aktivnost ili karakterističnu domenu (lipaze, esteraze, fosfataze, kinaze . . .)
- pronalaženje gena koji može komplementirati neku mutaciju
- pronalaženje potpuno novih (nepoznatih) gena i proteina, istraživanje njihovih karakteristika i bioloških uloga

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

nabroji strategije za pretraživanje banke gena

A

Komplementacija mutacije
Umnažanje željene DNA pomoću PCR-a
Imunološka detekcija
Hibridizacijske metode (komplementarno sparivanja)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

što je komplementacija mutacija

A

traženi gen komplementira mutaciju (najjednostavnije za biosintetske putove)
transformirane stanice koje sadrže traženi gen rastu na selektivnoj podlozi
neophodno je da se gen eksprimira u stanici domaćinu
moguće za relativno mali broj gena

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

što je umnažanje željene DNA pomoću PCR-a

A

potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
za samo pretraživanje nije potrebna ekspresija gena

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

što je imunološka detekcija

A

vizualizacija koja se osniva na vezanju specifičnih obilježenih protutijela na željeni protein (antigenu determinantu) – ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
neophodna ekspresija gena

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

što su hibridizacijske metode

A

postojanje traženog gena se vizualizira komplementarnim sparivanjem s obilježenom DNA (proba, sonda)
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
nije potrebna ekspresija gena

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

objasni pretraživanje komplementacijom

A
  1. uzme se genom S. cerevisiae koji je Leu+ (može sam sebi sintetizirati leucin) i taj se genom fragmentira
  2. ti se fragmenti pomiješaju s plazmidom koji je lineariziran
  3. radi se ligacija plazimida i fragmenata te nastaju kružni vektori koji sadrže fragmente genoma kvasca
  4. transformiraju se E. coli koje su leu- (imaju mutaciju u LeuB) i transformirane stanice nacjepljujemo na podlogu bez leucina
  5. izrastu samo one kolonije koje imaju plazmid s genom Leu+
  6. izdvojimo porasle stanice na podlozi bez leucina i uzgojimo ih do većeg broja te izoliramo plazmid
  7. transformiramo stanice kvasca koje su leu- s tim plazmidom koji je Leu+ i dolazi do komplementacije mutacije i sada sve stanice rastu na podlozi bez leucina
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

objasni pretraživanje pomoću PCR-a

A

potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena
u genomskoj banci potrebno je pronaći klon koji sadrži traženu sekvenciju/gena
kao kalup za PCR najprije se koriste skupine združenih klonova (10 po 10 uzoraka koji sadrže klonove)
kad se identificira pozitivan uzorak skupina se podijeli u podskupine itd., sve dok se ne pronađe željeni klon
problemi - uspješnost PCR reakcije (lažno negativni rezultati)
- nespecifična sinteza (“parazitske vrpce”) – lažno pozitivni rezultat

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

objasni imunološko pretraživanje

A

osniva se na specifičnom vezanju protutijela na protein koji nastaje ekspresijom traženog gena
traženi gen se mora eksprimirati - često je potrebno „prekloniravanje” u drugi vektor i organizam
vizualizacija pomoću obilježenih protutijela - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

koja su dva osnovna pristupa imunološkom pretraživanju

A

(1) - specifična protutijela su označena radioaktivitetom ili fluorescencijom
(2) - na protutijelo je vezan enzim koji katalizira kolornu reakciju (peroksidaza, alkalna fosfataza…)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

objasni ELISA-u

A
  • 1 specifično protutijelo se nalazi na dnu jažice/bunarčića
  • protein se specifično veže na 1. protutijelo
  • onda se sve ispire tako da ostane samo vezani protein
  • zatim se dodaje 2. specifično protutijelo koje se veže s gornje strane na vezani protein i ponovno se ispire
  • dodaje se protutijelo za detekciju, ono ima vezani enzim na sebe i dodaje se supstrat koji će se specifično vezati na enzim i dati će neko obojenje kako bi ga mogli detektirati
17
Q

objasni pretraživanje hibridizacijskim metodama

A

osniva se na vizualizaciji pozitivnog klona zahvaljujući komplementarnom sparivanju (hibridizaciji) s obilježenom DNA
potrebno poznavanje barem dijela sekvencije traženog gena

18
Q

što je obilježena proba (sonda)

A

nukleinska kiselina (gotovo uvijek DNA) koja sadrži modificirane nukleotide koji omogućavaju njenu vizualizaciju
radioaktivni nukleotidi - vizualizacija autoradiografijom na rendgenskom filmu
fluorescentni nukleotidi - očitavanje odgovarajuće valne duljine
kemijski modificirani nukleotidi (digoksigenin) - vezanje odgovarajućeg protutijela na kojem je vezan enzim
(imunološki pristup)

19
Q

kako se radioaktivno obilježava DNA i RNA

A

najčešće korišteni radioaktivni izotopi u biologiji i biokemiji - 25I, 3H, 35S i 32P
nukleinske kiseline obilježavaju se ugradnjom 32P u fosfatnu skupinu ili ili 35S u tiofosfatnu skupinu

20
Q

za što se koriste radioaktivni nukleotidi

A

kao prekursori za sintezu polinukleotidnog lanca ([α-32P]dNTP)
kao donori fosfatne skupine tijekom fosforilacije ([γ-32P]ATP)

21
Q

objasni obilježavanje krajeva mol. NK

A

koriste se probe niske specifične radioaktivnosti jer su od cijele molekule obilježeni samo krajevi
(1) polimerazna aktivnost - na 3’-uvučenom kraju (npr Klenow fragment)
(2) Taq polimeraza - na ravnom kraju dodaje dATP na 3’-OH
(3) terminalna deoksiribonukleotidil transferaza - dodaje nukleotide na 3’-krajeve jednolančane i dvolančane DNA
(4) polinukleotid fosfataza/kinaza - zamjena fosfatne skupine na 5’-kraju ssDNA, dsDNA, ssRNA

22
Q

objasni jednoliko obilježavanje mol. NK i nabroji metode

A

koriste se probe visoke specifične radioaktivnosti jer DNA fragment obilježavamo cijelom duljinom
metode - pomak zareza (”nick translation”), pomak jednolančanog loma
- nasumično započinjanje (“random priming”)
- PCR
- transkripcija in vitro

23
Q

što je pomak zareza “nick translation”

A
  1. imamo linearnu ili kružnu dsDNA
  2. DNaza I (u prisustvu Ca2+ i Mg2+ uvodi jednolančani lom)
  3. DNA polimeraza I; jedan od nukleotida je radioaktivan (dATP, dTTP, dCTP ili dGTP) jer
    sadrži 35S ili α-32P - koristi svoju 5’-3’ nukleaznu aktivnost
  4. istovremenom degradacijom i sintezom DNA u smjeru 5’-3’ nastaju dugačke obilježene regije
24
Q

što je nasumično započinjanje -“random priming”

A
  1. kalup za sintezu - jednolančana DNA (najčešće kružna) ili dvolančana denaturirana DNA (zagrijana na 95°C i
    naglo ohlađena na 4°C)
  2. klica - smjesa svih kombinacija heksa i/ili heptanukleotida (tako da smo sigurni da će se neki od nukleotida kompl. spariti)
  3. polimeraza - Klenow fragment ili neka druga polimeraza koja nema 5’-3’ egzonukleaznu aktivnost (ne koristi se DNA-pol I jer ona bi skinula početnice i išla stalno u krug); u reakcijskoj otopini, jedan nukleotid je radioaktivan
  4. nastaje dsDNA u kojoj je jedan lanac obilježen
25
Q

objasni označavanje pomoću PCR-a

A

istovremeno umnažanje ciljne sekvencije i ugradnja radioaktivnih nukleotida
gotovo svim molekulama označena su oba lanca - visoka specifičnost

26
Q

objasni označavanje transkripcijom in vitro

A

sinteza radioaktivne RNA
ekspresijski vektori - inserti između viralnih promotora (T7, T4. . .)
- moguća transkripcija jednog ili drugog lanca
nakon provedene transkripcije, DNA se degradira pomoću DNaze I

27
Q

objasni pretraživanje hibridizacijom kolonija

A
  1. klonove iz banke gena nacijepimo na podlogu
  2. nakon što izrastu kolonije, na nitroceluloznu membranu preslikamo kolonije i tu membranu preslikamo na drugu hranjivu podlogu
  3. stanice kolonija koje su izrasle na membrani liziramo i imamo DNA vezanu na membranu koju onda denaturiramo
  4. tu membranu stavimo u otopinu u kojoj se nalaze obilježene sonde (radioaktivna DNA) i one se komplementarno sparuju s jednolančanom DNA
  5. radimo autoradiografiju i ona koja je crna je ona koja sadrži DNA koju smo tražili
  6. slijedi identifikacija i uzgoj pozitivne kolonije
28
Q

koji su problemi i rješenja kod hibridizacije kolonija

A

problemi - zaštita osoblja i okoliša, zahtjevno rukovanje, cijena, administracija
rješenje - upotreba neradioaktivnih proba

29
Q

što su neradioaktivne probe (sonde)

A

sonde sadrže kemijski modificirane nukleotide - imaju na sebe vezanu kemijsku skupinu koja djeluje kao antigen
za sintezu neradioaktivnih sondi koriste se iste metode kao i pri sintezi radioaktivnih sondi

30
Q

kako se detektiraju neradioaktivne sonde

A

neposredno - fluorescentne probe, sadrže fluorescentne nukleotide
posredno (imunološki) - vezanjem protutijela na antigene koji su vezani na sondu
- antitijelo se može detektirati jer je fluorescentno ili jer se na njega veže enzim koji provodi reakciju koja se može vizualizirati

geneticko inz 2 parc (7 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions