GI na kvascu S. cerevisiae

Question 1

što je genetička transformacija

Answer 1

postupak unošenja DNA (transformirajuća DNA - DNA koju unosimo) koji uzrokuje promjenu genotipa i fenotipa transformirane stanice

Question 2

kako dijelimo transformirajuća DNA

Answer 2

na replikativnu i nereplikativnu (integrativnu)

Question 3

što je replikativna DNA

Answer 3

sadrži ishodište replikacije
u stanici kvasca se može samostalno replicirati
–> da bi transformirala kvasac, nije potrebno da se ugradi (integrira) u kvašćev genom

Question 4

što je nereplikativna (integrativna) DNA

Answer 4

ne sadrži ishodište replikacije
u stanici kvasca se ne može samostalno replicirati
–> da bi transformirala kvasac, mora rekombinirati s kvaščevom DNA

Question 5

nabroji replikativne vektore kvasca S. cerevisiae

Answer 5

YEp („yeast episomal plasmid”) - imaju ishodište replikacije iz plazmida 2μ
YRp („yeast replicative plasmid”) - imaju ishodište replikacije iz kromosoma kvasca
YCp („yeast centromeric plasmid”) - sadrže ishodište replikacije i centromeru iz kvasca
YAC („yeast artificial chromosome”) - sadrže ishodište replikacije, centromeru i telomere iz kvasca

Question 6

nabroji i objasni integrativne vektore kvasca S. cerevisiae

Answer 6

YIp („yeast integrative plasmid”) - plazmidi koji ne sadrže ishodište replikacije u kvascu - za transformaciju se mogu koristiti u kružnom obliku ili u lineariziranom obliku (cijepanje restrikcijskim enzimima prije transformacije)
Linearni fragmenti DNA za rekombinaciju „ends-out” (zamjenu gena) - spomenuti kod funkcionalne analize genoma – za zamjenu gena
- na transformirajućoj DNA, osim gena za selekciju transformanata mogu se nalaziti i drugi geni, a iz genoma se mogu ukloniti relativno velike regije DNA koje mogu sadržavati više gena

Question 7

objasni transformaciju kružnim integrativnim plazmidima

Answer 7

• imamo DNA koja ima neki gen mutiran (npr. ura3)
• imamo plazmid koji ima aktivan gen koji je inaktivan na DNA i još ima jedan drugi aktivan gen (URA3 i LEU2)
• može doći do transformacije na dva načina:
  1. dolazi do konverzije gena bez crossing-overa (recipročne zamjene) i tu ne dolazi do ugradnje plazmida u genom nego do konverzije gena, ura3 postaje URA3 (ta DNA je sada Ura+Leu-)
  2. dolazi do crossing-overa (on može biti poprećen konverzijom gena, ali i ne mora) i ugradnje plazmida u genom (DNA je sada Ura+Leu+)

Question 8

objasni transformaciju lineariziranim integrativnim plazmidima

Answer 8

• imamo plazmid koji je pocijepan u jednom genu
• krajevi plazmida traže homologiju u genomu kvasca i nalaze ju samo u crvenoj regiji (gen koji je jednak genu s plazmida)
• dolazi do popravka dvolančanog loma na dva načina:
  1. bez crossing-overa - plazmid se ne ugrađuje u genom, na kraju dobijemo kružni plazmid koji je popravljen prema homolognom lancu
  2. uz crossing-over - dolazi do ugradnje plazmida u genom kvasca
  taj cijeli postupak se zove gene-targeting (gensko ciljanje) jer se ciljano mijenja određeni gen i to je rekombinacija ends-in

Question 9

što je rekombinacija pop-out

Answer 9

intrakromosomska homologna rekombinacija između istosmjernih ponavljanja koja rezultira gubitkom jednog ponavljanja i cjelokupne sekvencije između ponavljanja
može ali i ne mora rezultirati nastankom kružne DNA (koja se može samostalno replicirati ako sadrži ishodište replikacije)

Question 10

objasni mehanizam pop-out rekombinacije

Answer 10

(1) može bit pravi pop-out gdje dolazi do homologne rekombinacije između istosmjerno ponovljenih sekvencija
(2) ili može biti SSA (single-strand anealing) gdje nastaje dvolančani lom između dvije istosmjerne ponovljene sekvencije, zatim nastaju dugi 3’-krajevi koji su komplementarni i kada se spare dvolančana struktura koja ima stršeću jednolan. DNA koju uklanjaju enzimi i na kraju dobijemo DNA za jednu sekvenciju kraću

Question 11

objasni zamjenu gena (gene replacement)

Answer 11

imamo rekombinaciju end-out - model za gensku terapiju
doslovno dolazi do zamjene gena
na transformirajućoj DNA, osim gena za selekciju transformanata mogu se nalaziti i drugi geni, a iz genoma se mogu ukloniti relativno velike regije DNA koje mogu
sadržavati više gena

Question 12

objasni homolognu i ilegitimnu integraciju YIp-a

Answer 12

transformacija kružnim plazmidom se može dogoditi homolognom rekombinacijom i u nekim slučajevima ilegitimnom (plazmid se može ugraditi u bilo koje mjesto na DNA)
netransformirani soj je auksotrofni mutant
transformanti su selekcionirani kao prototrofi (mogu sebi sintetizirati tvari rasta)
proba za Southern blot je samo vektor (onaj dio plazmida bez gen)
rezultate Southern blota - za HR su sve vrpce jednake (predstavljaju dva kraja vektora na koji su se spojile sonde); za IR su različite vrpce jer se DNA mogla ugraditi na bilo koje mjesto pa nastaju bilo koja dva fragmenta, za K nema vrpci jer može biti da je došlo do konverzije gena pa nema ugradnje plazmida

Question 13

objasni jednostruku i višestruku integraciju YIp-a

Answer 13

integracija plazmida može biti jednostruka (ugradila se jedna kopija trans. DNA) ili može biti višestruka (ugrađuje se više kopija transformirajuće DNA)
transformanti su selekcionirani na podlozi bez leucina
proba za Southern je URA3 koja se nalazi na plazmidu
rezultati: HR - došlo do homologne rekombinacije i vide se 2 vrpce koje odgovaraju veličinama plazmida i fragmenta DNA
HRm - imamo 3 vrpce, ova koja odgovara veličini od 5kb predstavlja višestruku integraciju plazmida
K - ima jednu vrpcu koja veličinom odgovara veličini fragmenta DNA, može biti da je došlo do konverzije gena ili je to kontrola

Question 14

koja je primjena integrativnih i replikativnih plazmida

Answer 14

precizna modifikacija kvaščevog genoma (nekog gena ili bilo koje sekvencije)
inaktivacija, razaranje gena, „gene disruption”
kloniranje točno određenog gena ili sekvencije iz genoma kvasca

Question 15

koja je primjena fragmenata DNA za rekombinaciju ends-out

Answer 15

zamjena gena i inaktivacija gena

Question 16

objasni preciznu modifikaciju gena

Answer 16

1. potrebno plazmid koji ima selektivni biljeg (URA3) i sekvencu koju želimo promijeniti u kvascu - ta sekvenca sadrži mutaciju koju želimo uvesti u genom kvasca
2. takvim plazmidom transformiramo kvasac i selekcioniramo na podlozi bez uracila (rastu samo oni koji imaju ugrađen plazmid u genom kvasca)
3. treba napraviti pop-out, ide uzgoj u kompletnoj podlozi gdje dolazi do pop-outa, zatim nacjepljujemo na podlogu s 5-FOA i prežive samo oni kod kojih je došlo do pop-outa jer nemaju više ura3 i on ne koristi 5-FOA i ne nastaje toksičan produkt dok kod ovih koji imaju još ura3, tj nije došlo do pop-outa dolazi do nakupljanja toksičnog produkta i stanica umire
4. analiza - PCR, restrikcijska analiza, Southern blot, sekvencioniranje

Question 17

objasni razaranje (disrupciju) gena

Answer 17

na plazmidu se nalazi samo središnji dio željenog gena (plazmid se može linearizirati), dolazi do ugradnje plazmida u genom i imamo dvije kopije gena, ali jednoj kopiji nedostaje jedan kraj, a drugoj drugi –> nastaje mutirani gen

Question 18

objasni kloniranje gena ili bilo koje
sekvencije

Answer 18

1. sekvenca koja nas zanima se stavi na plazmid i napravi se dvolančana praznina u toj sekvenci
2. transformacija stanica
3. mogu nastati stabilni transformanti (dvolančana praznina se popravi prema neoštećenoj DNA i plazmid se ugradi u genom) ili nestabilni transformanti (praznina se popravi, ali ne dođe do CO i ugradnje plazmida, plazmid ostaje u kružnom obliku, ali bez dvolanč. praznine)
4. nama trebaju nestabilni transformanti, do njih dođemo izolacijom DNA, transformacijom E. coli i izolacijom plazmida

Question 19

što je mutageneza in vitro i koja dva pristupa postoje

Answer 19

uvođenje mutacija u kloniranu DNA
svrha - analiza uloge gena i proteina
- proteinski i metabolički inženjering
postoji nasumična mutageneza i ciljana mutageneza in vitro

Question 20

nabroji metode ciljane mutageneza in vitro

Answer 20

korištenjem restrikcijskih i modifikacijskih enzima, PCR i mutageneza metodom po Kunkelu

Question 21

objasni ciljanu mutagenezu pomoću restrikcijskih i modifikacijskih enzima

Answer 21

imamo neko restrikcijsko mjesto, pocijepamo ga i nastaju istureni jednolančani krajevi koji se mogu popraviti na dva načina
(1) DNA-pol popunjava krajeve i nastaju ravni krajevi, dolazi do ligacije i nastaje mutirana DNA (frame-shift, dodano 4pb)
(2) neka nukelaza ukljanja isturene krajeve, dolazi do ligacije i nastaje mutirana DNA (isto frame-shift)

Question 22

objasni ciljanu mutagenezu pomoću PCR-a

Answer 22

potrebna dva para početnica - za umnažanje cijelog fragmenta DNA (p1 i p2)
- mutagene klice (m1 i m2) - sadrže željenu mutaciju i međusobno su komplementarne
postupak:
1. DNA koja je dobivena umnažanjem s početnicama p1 i p2 podijeli se u dva dijela - jedan dio: PCR u prisutnosti p1 i m1
- drugi dio: PCR u prisutnosti p2 i m2
2. dvije otopine se pomiješaju, denaturiraju i renaturiraju, dobijemo puno početnih molekula, ali i nešto mol. gdje su sparene m1 i m2 početnice te imaju velike isturene krajeva
3. komplementarni lanci se sintetiziraju pomoću polimeraze (5’-3’-pol aktivnost)
4. cijeli fragment koji sadrži mutaciju se umnoži pomoću p1 i p2 - sve molekule veličine cijelog fragmenta sadrže željenu mutaciju