sekvencioniranje i funkcionalna analiza

Question 1

što je shotgun sekvencioniranje

Answer 1

sekvencioniranje pogodno za male genome koji nemaju puno ponovljene DNA (virusi, bakterije)

Question 2

što je hijerarhijsko shotgun sekvencioniranje

Answer 2

sekvencioniranje pogodno za velike genome u kojima ima puno ponavljajuće DNA (životinje, biljke) - satelitna DNA, pseudogeni, pokretni genetički elementi

Question 3

objasni shotgun sekvencioniranje

Answer 3

1. treba se izloirati DNA iz organizma čiji genom želimo sekvencionirati
2. taj se genom fragmentira na puno fragmenata veličine 1000pb i ti se fragmenti međusobno preklapaju
3. onda se radi banka gena - fragmenti se koriste kao inserti i ubacuju u vektore, transformanti E. coli se pohranjuju u banci gena
4. uzima se jedan po jedan uzorak, izolira se plazmidna DNA i provodi se sekvencioniranje s dvije početnice, s jednom se početnicom sekvencionira jedan lanac, a s drugom drugi lanac
5. računalni softver te fragmente (nastali sekvencioniranjem) spaja i dobijemo niz nukleotida genoma organizma

Question 4

kakvo je shotgun sekvencioniranje

Answer 4

neprikladno je za velike genome s puno ponovljene DNA
prikladnije za manje (bakterijske i virusne) genome

Question 5

objasni hijerarhijski shotgun

Answer 5

1. genom se fragmentira na puno veće fragmente (150Mb)
2. radi se banka gena u BACovima ili YACovima (inserti veličine oko 150MB)
3. nije moguće sekvencionirati cijeli insert jer su fragmenti predugački pa se sekvencioniraju samo krajevi
4. fragmenti se pohranjuju u računalo i ono traži preklapanje krajeva da složi kostur fragmenta
5. nakon toga se svaki fragment sekvencionira shotgun metodom i zatim se provodi dideoksi metoda
6. dobiju se sekvence tih malih fragmenata te na kraju dobijemo sekvencu cijelog genoma

Question 6

nabroji metode sekvencioniranja DNA

Answer 6

Maxam–Gilbertova (kemijska metoda)
Sangerova (dideoksi) metoda - najčešća metoda sekvencioniranja, automatizirana, elektroforeza u kapilari; fluorescentni dideoksi nukleotidi
Next-generation sequencing (sekvencioniranje nove generacije)

Question 7

što je genom

Answer 7

cjelokupni kodirajući i nekodirajući genetički materijal (kromosomski i nekromosomski) organiziran na točno određeni način

Question 8

što je gen

Answer 8

dio DNA koji kodira za neki protein ili molekulu RNA uključujući regulatorne regije (introni, egzoni i regulatorne regije)

Question 9

koji je bio prvi sekvencionirani eukariotski genom

Answer 9

genom kvasca Saccharomyces cerevisiae (~13000kb)

Question 10

opiši genom kvasca Saccharomyces cerevisiae

Answer 10

16 kromosoma (u haploidnom obliku)
ima mitohondrijsku DNA (85,8 kb) i plazmid 2μ (6,3 kb)
sadrži kromosomalnu DNA (39% C+G)
- bez rDNA: 12.052 kb
- rDNA (9,1 kb - duljina jedne kopije) - ~150 kopija; na 12. kromosomu
ima oko 5800 gena
prosječni ORF je duljine 1450 pb; GC-sastav: 40,2 %
samo 10% proteina ima više od 650 aminokiselina
ima ukupno samo 233 introna (duljine 500pb) što nije tipično za eukariote

Question 11

koliko posto ukupnog genoma čine kodirajuće sekvence

Answer 11

66% –> ima jako gust genom

Question 12

objasni evoluciju i duplikaciju genetičkog materijala

Answer 12

ako se neki gen nalazi u samo jednoj kopiji onda se on ne smije jako mijenjati, inače može doći do smrti stanice - to je konzervirani gen
taj isti gen se može duplicirati i onda se jedna kopija može značajno mijenjati jer postoji druga kopija tog gena koja je zadržala svoju funkciju - ovaj izmijenjeni gen može dati neku novu funkciju ili prednost organizmu

Question 13

što se može raditi nakon sekvencioniranja

Answer 13

genomska istraživanja
- bioinformatika (analiza sekvencije) - genomika, proteomika, transkriptomika…
- eksperimentalni genomski pristupi - sustavna inaktivacija (delecija) gena – „reverzna genetika”; interakcije proteina (sustav dva hibrida, „two hybrid system”); ekspresijski profil cijelog organizma – transkriptomika (DNA čipovi)
“ne-genomski” eksperimenti
- potvrda ili odbacivanje neke specifične hipoteze

Question 14

što je funkcionalna analiza

Answer 14

sustavna inaktivacija svakog pojedinog kvaščevog gena u cilju otkrivanja/potvrđivanja njegove uloge (funkcije)

Question 15

što je reverzna genetika

Answer 15

imamo gen, promijenimo ga i gledamo kako se mijenja fenotip

Question 16

objasni funkcionalnu analizu genoma S. cerevisiae

Answer 16

1. prvo je potrebno konstruirati disrupcijsku kasetu - to radimo provođenjem PCR-a koji umnaža neki selektivni biljeg (npr. rezistencija na neki antibiotik)
2. zatim se transformira kvasac - dolazi do homologne rekombinacije, mehanizam ends-out i do zamjene gena
3. selekcija transformanata na podlozi s geneticinom i provjera konstruiranih sojeva (PCR-trebali bi dobiti samo sekvence koje imaju dio genoma kvasca i dio ugrađenog gena ako je kaseta dobro ugrađena; Southern blotom)
4. analiza mutanata (rastu samo oni sojevi kod kojih se kaseta ugradila u genom)

Question 17

što je disrupcijska kaseta

Answer 17

fragment DNA koji omogućava inaktivaciju (deleciju, izbacivanje, disrupciju) nekog određenog gena

Question 18

objasni funkcionalnu analizu primjenom sustava Flp/FRT

Answer 18

1. željena kaseta se nalazi između dvije FRT sekvence, PCR-om dobijemo kasetu koja na krajevima ima FRT sekvence
2. dolazi do ugradnje kasete u genom kvasca i izlaska gena na čije mjesto dolazi kaseta
3. uzgoj u tekućoj podlozi bez geneticina (tako da se izreže kaseta van?, koriste se rekombinaze Flp da zamijene sekvencije i kaseta izađe van)
4. nacjepljivanje na krutu hranjivu podlogu bez geneticina da se dobiju kolonije
5. repliciranje na podlogu s geneticinom
6. odabir kolonija osjetljivih na geneticin i mol. analiza

Question 19

objasni određivanje ekspresijskog profila

Answer 19

primjena DNA-čipova
1. jednolančana DNA je vezana na pločicu
2. uzme se uzorak zdravog tkiva, izolira se mRNA, radi se reverzna transkripcija s označenim nukleotidima, zdravo tkivo je npr. označeno zelenom bojom
3. isto se napravi s tumorskim tkivom, ali je ono obilježeno s crvenom bojom
4. jedna se pločica uroni u otopinu s jednom obilježenom DNA, a druga u otopinu s drugom obilježenom DNA
5. dolazi do hibridizacije i emisije fluorescencije
6. rezultati se računalno obrađuju
7. oni geni koji su crveni se jače eksprimiraju u tumorskim stanicama, oni koji su jače zeleni se više eksprimiraju u zdravim stanicama, oni koji su podjednakog intenziteta se podjednako eksprimiraju i u zdravim i u tumorskim stanicama

Question 20

objasni postupak mikropolja za S. cerevisiae

Answer 20

1. priprema mikropolja - umnažanje svih 6183 ORF-a pomoću PCR-a (12.366 klica)
   - nanošenje umnožene DNA na pozitivno nabijeni nosač
2. izolacija RNA - smrzavanje stanica i mehaničko razbijanje i
3. priprema probe (uzorka) - reverzna transkripcija, fluorescentne klice; pročišćavanje, denaturacija
4. hibridizacija - 65°C /20 h
5. rezultati - računalni programi za očitavanje i pohranu rezultata
6. analiza rezultata - normalizacija prema standardu, usporedba s kontrolnim uzorkom; grafička prezentacija rezultata

Question 21

što je detekcija proteinskih interakcija

Answer 21

metoda za određivanje da li neka dva proteina stupaju u fizički kontakt in vivo

Question 22

objasni detekciju proteinskih interakcija

Answer 22

potrebni su C-terminalni dio koji ima interakcija s RNA polimerazom II i N- terminalni dio koji veže se na DNA
imamo: hibrid 1 koji ima protein X fuzioniran s N-krajem proteina Gal4 - fuzijski gen na jednom plazmidu
hibrid 2 koji ima protein Y fuzioniran s C-krajem proteina Gal4 - fuzijski gen na drugom plazmidu
ako proteini X i Y stupaju u interakciju transkripcija se normalno odvija i nastaje aktivna beta-galaktozidaza i imamo plavo obojenje
ako proteini X i Y ne stupaju u interakciju nema transkripcije i ne nastaje veta-galaktozidaza te nema plavog obojenja
fuzionirani geni moraju biti u istom okviru čitanja