genetičke modifikacije biljaka i životinja Flashcards
koji organizmi se mogu genetički manipulirati
višestanični, visokodiferencirani organizmi - spolne stanice, somatske stanice, oplođene jajne stanice, matične stanice
koja je primjena genetičkih manipulacija biljaka i životinja
temeljna istraživanja, farmaceutika, medicina, stočarstvo, poljoprireda, biotehnologija
što je transfekcija
unošenje DNA u stanicu, isto što i transformacija samo što se transformiraju višestanični organizmi
nabroji tehnike unošenja DNA u biljne i životinjske stanice
protoplastiranje i fuzija protoplasta
injektiranje direktno u jezgru (volumen od 2 pL!)
virusi (retrovirusi) - “transdukcija”
liposomi - DNA okružena lipofilnim slojem
elektroporacija - kratki puls visokog napona
biolistička transformacija - bombardiranje česticama na kojima se nalazi DNA (“gene gun”)
Agrobacterium tumefaciens - Ti-plazmid – genetičke modifikacije biljaka
opiši Agrobacterium tumefaciens
to je gram-negativna, nesporogena, štapičasta, pokretna je, živi u tlu, nepatogena za čovjeka
kad osjeti da je biljka ozlijeđena, kemotaksijom dolazi do biljke, ulazi u međustanični prostor i uzrokuje tumor vrata korijena koji počinje proizvoditi opine
što je plazmid Ti
ima ga bakterija Agrobacterium tumefaciens
sadrži - T-DNA – „transfer DNA”; čini oko 10% cijelog plazmida; prenosi se u biljnu stanicu; sadrži gene za sintezu hormona koji potiču diobu biljnih stanica i gene za sintezu opina (svi geni imaju biljne promotore)
- LB – „left border” i RB – „right border˝ - omeđuju T-DNA, ključne za prijenos T-DNA; direktna ponavljanja (~25 pb)
- vir – geni odgovorni za virulentnost; omogućavaju spajanje bakterijske i biljne stanice i prijenos T-DNA u biljnu stanicu
- ori – ishodište replikacijeu A. Tumefaciens
- geni za korištenje opina
kako dolazi do ugradnje Ti plazmida u biljnu stanicu
ozlijeda na biljci uzrokuje kemotaksiju i indukciju vir-gena
uvođenje jednolančanog loma u LB
prijenos jednolančane T-DNA (od LB do RB; ~23 kb) iz bakterije u biljnu stanicu
ilegitimna integracija T-DNA u biljni genom
ekspresija T-DNA u biljnoj stanici uzrokuje nekontroliranu diobu biljnih stanica i izlučivanje opina u međustanični prostor
A. Tumefaciens opine koristi kao hranjive tvari jer plazmid Ti sadrži gene za njihovo metaboliziranje
objasni ulatak T-DNA u biljnu stanicu
- protein VirA je senzor za signale iz okoline i aktivator proteina VirG
- fosforilirani protein VirG aktivira vir gene
- sinteza proteini VirD1 i VirD2
- proteinski kompleks VirD1-VirD2 cijepa jedan lanac DNA u LB i RB
- protein VirD2 ostaje vezan na 5’-kraju jednolančane DNA (jednolančana praznina u plazmidu se resintetizira)
- DNA u blijnu stanicu ulazi kroz “T-pilus” koji izgrađuje protein VirB a u stanicu ulazi i protein VirE2
- u biljnoj stanici VirE2 prekriva T-DNA te nastaje “T-kompleks” u kojem je DNA zaštićena od nukleaza, prolazi kroz jezgrinu membranu (NPC – nuclear pore complex) uz pomoć proteina domaćina
- proteini VirE1 i virD2 se degradiraju, a jednolančana DNA se ugrađuje u genom ilegitimnom rekombinacijom
koja je primjena Ti plazmida
bilo koja DNA koja se ugradi između LB i RB bit će prenešena u biljnu stanicu
postoji restrikcijsko mjesto između LB i RB sekvenci, tu pocijepamo i ugradimo gen koji želimo ugraditi u biljku, takvim rekombinantnim plazmidom inficiramo i transformiramo biljnu stanicu
koji su problemi i rješenja kod primjene Ti plazmida
problemi - zbog svoje veličine plazmid Ti nije pogodan za manipulaciju
- biljka se ne može regenerirati iz tumora
rješenja - kloniranje na manjim plazmidima u E. Coli
- prijenos plazmida konjugacijom (iz E. coli u A. tumefaciens)
- rekombinantni plazmidi koji ne uzrokuju pojavu tumora
- najčešće korišteni sustav - binarni sustav (pomoću dva plazmida)
objasni binarni sustav
„razoružani Ti-plazmid” („disarmed Ti plasmid”) - između LB i RB, umjesto T-DNA, sadrži gen koji se prenosi u biljnu stanicu i
biljeg za selekciju transformiranih biljnih stanica (najčešće kanR, kanamicin)
- ne sadrži gene za sintezu biljnih hormona
- ne sadrži gene za sintezu opina
- ne sadrži vir-gene
- ne sadrži gene za korištenje opina
- konstruira se u E. Coil
- može se replicirati i u E. Coli i u A. Tumefaciens (sadrži dva ori mjesta)
- iz E.coli u A. Tumefaciens se može prenijeti konjugacijom
pomoćni plazmid („helper vector”) - sadrži vir-gene (da može doći do infekcije i da se DNA koju smo mi dodali može unijeti u biljku)
koji je postupak binarnog sustava
postupak:
infekcija biljke s rekombinantnom bakterijom A. Tumefaciens koja sadrži oba plazmida, selekcija transformiranih biljnih stanica, regeneracija biljke iz transformiranih stanica
koja je najčešća metoda infekcija biljke A. tumefaciensom
najčešća metoda je infekcije lisnih diskova - izrežu se diskovi iz lista biljke, zatim se utisnu na hranjivu podlogu na čijoj je površini gusto narasla A. tumefaciens, zatim se selekcionira nediferencirano biljno tkivo i to tkivo tretiramo nečim i dobijemo da iz svake stanice možemo dobiti jednu novu transgenu biljku
objasni rajčicu sa smanjenom aktivnošću poligalakturonaze
takva biljka ima inaktivan gen za poliglakturonazu koji kodira za enzim poligalakturonazu koji uzrokuje truljenje rajčice, ima antisense oblik tog gen (kodirajuća DNA je okrenuta za 180° u odnosu na promotor, terminator)
koja je primjena antisense vektora
imamo antisense gen i normalan gen i oni daju antisense mRNA i mRNA, te dvije mRNA su komplementarne i dolazi do njihovog sparivanja i nastaje dsRNA koja se puno teže translatira i ona se u biti razgrađuje (inteferencija RNA) i zapravo dobijemo stanicu u kojoj je samo 1% aktivna polialakturonaza
