Separationstekniker Flashcards
Nämn nån separations teknik?
kromatografiska tekniker
Varför vill man separera ?
För att kunna studera ett ämnes egenskap och struktur. och bestämma halten av ett ämne (ex droger/lkm)
- Biomolekyler som tex proteiner eller cellkomponenter osv går bara att studera med biokemiska och analytiska tekniker om de kan renas från övriga komponenter.
Vad innebär proteinmodifiering?
Proteinmodifieringar på ett specifikt protein kan studeras om proteinet först anrikas från övriga proteiner mha extraheringskolonn (SPE-kolonnen)innan det studeras med masspektrometri
Hur kan man bestämma drog och lkm koncentration?
Läkemedel eller droger och liknande ämnen kan haltbestämmas (kvantifieras) om de separeras med en vätskekromatografisk metod som tex HPLC och detekteras med lämplig metod. Resultatet åskådliggörs som ett kromatogram.
Vad är utmaningar med separationen ?
skillnad i bland annat; viskositet, salter, pH lipider, proteiner, blodceller osv.
Hur kan man bestämma ämnen utan separation?
Coulometrisk enzymatisk för att bestämma de ämnen det finns mest av i en matris behöver man inte alltid separation innan detektion och metoden kan bli förhållandevis enkel.
Hur fungerar immunobaserad?
Ju längre ned i koncentrationerna vi söker oss, ju mer avancerade detektionsmetoder behöver vi, men vi behöver också någon form av separation. Vanligtvis kommer man undan med tex centrifugering.
Hur fungerar masspektrometern?
För att mäta de ämnen som finns i mycket låga koncentrationer tex pmol/L området så behövs de mest känsliga detektionsmetoderna kombinerat med de mest effektiva separationsmetoderna. Ibland behöver separationen göras i flera steg, tex centrifugering följt av fastfasupprening och slutligen vätskekromatografi innan detektion.
Hur fungerar centrifug och dess hastighet?
Centrifugering. Sedimenteringshastigheten kan fås att öka jämfört med gravitationen och man kan utföra sedimenteringar som aldrig hade uppstått annars. Hastigheten beror bla på partiklarnas storlek, vätskans viskositet och centrifugeringskraften.
Skillnade mellan RCF och RPM?
Det är viktigt att skilja mellan RCF och RPM. RCF beskriver kraften och RPM beskriver rotationshastigheten. Ofta vill man omvandla frpn RPM till RCF.
Generellt hur fungerar kromatografi?
-> Det flesta ämne som är i gasfas, flytandefas eller fastfas kan analyseras.
-> Analyten måste befinna sig i ett medium, den mobilafasen
-> den mobila fasen är vanligstvis en vätska.
-> Analyterna följer den mobila fasens vätska.
-> Baserat på analytens egenskaper tex, storlek, pH så kan analyten fås att interagera med en fas i fast form, denna fas kallas stationär.
-> Genom att modifiera den mobila fasen egenskaper så kan man kontrollera separationen som uppstår.
ETT TVÅFAS SYSTEM
Hur fungerar den stationära fasen?
Stationärfasen kan finns i mång olika former. Vanligt är packade kolonner därfastfasen finns på ytan av små porösa partiklar, eller på insidan av en mycket tunn glaskapillär, sk kapillärkolonn. Stationärfasen kan också vara fäst på ytan av något som tex fallet för tunnskiktskromatografi.
Vad finns det för olika kromatografs metoder?
gaskromatografi, vätskekromatografi, tunnskiktskromatografi mm
- > gaskromatografi innehåller den mobila fasen i gas
- > vätskekromatografi innehåller den mobila fasen vätska.
- > tunnskikts kromatografi använder sig av kapillär kraft
Hur kan man dela in vätskekromatografi?
- System med låg tryck brukas inte benämnas på något speciellt sätt.
- System med högre tryck brukar benämnas High pressure performance liquid chromatography, eller HPLC.
- De system som klarar de allra högsta trycken kallas ultra HPLC, UPLC eller UHPLC.
- > Om mekanismen är baserad på analytens laddning så kan man använda sig av jonbyteskromatografi
- > Om mekanismen är liganbinding mellan analyten och någon typ av prob så kan man använda sig av affinitetskromatografi
- > Om mekanismen är baserad på analytens storlek så kan man använda sig av gelfiltration
- > Om mekanismen är baserad på analytens hydrofobiscetitet så kan man använda sig av reversed phase kromatografi.
Vad innebär retention och selektivitet ?
- Tiden som analyt tillbringar på stationär fas beskrivs med retentionsfaktor
- skillnad mellan två analyter beskrivs med selektivitetsfaktorn
Hur beskriver man kolonnens effektivitet ?
- > För att beskriva kolonners effektivitet så används begreppet Teoretiska Bottnar N och de bör vara så många som möjligt, då rör sig analyten mer mellan faserna och möjligheten till separation ökar.
- > För att jämföra olika kolonners effektivitet så används begreppet bottenhöjd.
Vad är Van-deemter ekvationen ?
> > Ekevationen relaterar Bottenhöjden för en analytisk kolonn till olika flödes och kinetiska parametrar.
I en packad kolonn, storleken på partiklarna den viktigaste faktorn för att få hög kolonneffektivitet, ju mindre partiklar ju effektivare separation, men också högt mottryck, det är därför populärt med UPLC
Hur fungerar en vätskekromatografi?
Den fungera som tidigare nämnt kromatografi.
- > när provet injiceras och fastnar på fasta fasen, varpå den elueras av mha mobila fasen och flödar med denna till detektorn?
- > genom att kombinera olika fast faser och mobila faser kan man separera det ämne man är intresserad av ifrån andra ämnen i provet.
Hur är kolonnen i vätskekromatografi?
Består av olika modifierade partiklar.
- Det vanligaste är att de är modifierade på så sätt att de binder hydrofoba ämnen => ämnen fastnar om mobilfasen innehåller mycket vatten, lossnar om den innehåller mycket organiskt lösningsmedel. Detta kallas reversed phase.
Vad är den vanligast formen av reveres phase?
- Den vanligaste formen av reversed phase är sk C18-fas. Detta betyder att de porösa kiselpartiklarna har klätts med ett lager av kolkedjor som är 18 kol långa.
- De som är hydrofoba gillar ej att befinna sig i vattenfasen och har stor anledning att söka sig in bland C18 kedjorna. Hydrofila ämnen har ingen anledning att söka sig in bland C18 kedjorna eftersom de gillar vattenlösningen.
- Detta leder till att hydrofoba ämnen kommer att tillbringa längre tid på kolonnen och de kommer ut sent i kromatogrammet.
- man kan styra detta genom att modifiera hur länge ämnet befinner sig i kolonnen
Hur fungerar gelfiltrering ?
- Vanlig för att rena och analysera proteiner
- Stationärfasen består av inerta/stabila poräsa partiklar som är packade i en kolonn
- Separerar molekyler utifrån storlek
- Mobil fasen (buffert) flödar igenom kolonnen
- Molekyler som är små får en längre väg att vandra då de tar omvägen in i de porer som finns i gelen
Vad är jonbyteskromatografi?
- Separerar molekyler utifrån laddning
- katjonbytare binder positivt laddade molekyler
- Anjonbytare binder negativt laddade molekyler
- jonstyrka och pH viktigt för bindning och separation
- Stationär fasen består av material med funktionella grupper som är laddade
Hur fungerar konbyteskromatografi?
- Proteinerna elueras ut ur kolonnen med ökad jonstyrka eller ibland också ökat pH.
- Ökad salthalt medför fler Na+ och Cl- som tävlar med proteinerna om de laddade grupperna på stationär fasen
- När nettoladdningen är 0 så interagerar proteinet inte längre med stationär fasen
Hur fungerar tunnskiktskromatografi ?
- Instrumenteringen är enkel
- Stationär fas på en platta och mobilfas i botten av en behållare
- Separation när vätskan sugs uppåt
- Olika sätt att visualisera analyterna
- Populär som preperativ separation innan annan teknik
Vad är kapillärelektrofores?
Instrumenteringen är relativt enkel. Analyter i form av joner dras igenom kapillären mha ett elektriskt fält.
- Innerväggen i kapillären (kisel) har silanolgrupper som täcks av joner från bufferten (NaCl osv) som medverkar i separationen.
- Fungerar bra för biomolekyler såsom proteiner
Hur fungerar gaskromatografi?
> Om ämnena man vill analysera är lättflyktiga så kan man med fördel använda gaskromatografi.
Ämnen som ej är lättflyktiga kan göras mer lättflyktiga genom derivatisering, DVS man hänger på grupper som ändrar ämnets kemiska egenskaper.
Med gaskromatografi kan man få väldigt bra separation
Hur fungerar gaskromatografens kolonn?
Kolonnen, vanligtvis 10-30 m är ihop rullad och hänger i en ugn, när man ökar temperaturer i ugnen så eluerar ämnen loss ifrån filmen och följer med gasflödet till detektorn.
