Elektrofores

Question 1

vad är elektrofores?

Answer 1

är en process som gör det möjligt att separera molekyler baserade på storlek eller laddning.

• > Man använder ett elektriskt fält där molekyler så som DNA, RNA och proteiner kan vandra i gel gjorda av agaros eller polyakrylamid.
• > det elektriska fältet består av negativ laddning vid en ände som trycker molekylerna genom gelen, och en positiv laddning vid den andra änden som drar molekylerna genom gelen.

Question 2

inom vilka arbetsområden används elektrofores?

Answer 2

• Biokemi
• Medicin
• Molekylärbiologi
• rättskemin

Question 3

När används Agarosgelelektrofores?

Answer 3

fraktionerade proteiner/Elfores proteiner / elektrofores proteiner urin

Question 4

När används polyakrylamidgel/Isoelektrisk fokusering, ?

Answer 4

Fraktionerade proteiner / Elfores proteiner/ elektrofores proteiner serum/likvor

Question 5

Vad gör fraktionerade proteiner ?

Answer 5

Dem besvarar frågor som …
- inflammatorisk aktivitet 
- immunglobulinfördelning 
- Alfa-1-antitrypsinbrist
(förekomst av M-komponenten)

Question 6

Vad finns det för geltyper?

Answer 6

• > Agaros; som oftast används för sep av nukleinsyror.

- > Polyakrylamid; används oftast vid separation av proteiner

Question 7

Hur vandrar molekyler i gelerna?

Answer 7

Små molekyler vandrar fortare än större och vandrar därför längre i gelen.

Question 8

Hur fungerar buffert i elektrofores?

Answer 8

• Buffert i elektrofores används för att det ska finnas joner som bär strömmen, men också upprätthålla pH vid en relativ konstant värde.
• Det finns ett antal buffertar som används för elektrofores, vanligaste för nukleinsyror.

Question 9

Hur tillverkas polyakrylamid-gel?

Answer 9

Gelen byggs upp av akrylamid och metylen-bis-akrylamid. Förhållandet mellan dessa två ämnen avgör gelens porstorlek.

• > akrlyamid i lösning är giftigt.
• > När väl gelen är gjuten och polymeriseringen klar är produkten ofarlig.

Question 10

Hur fungerar lösningarna som bildar polyakrylamid gelen?

Answer 10

• Bis-akrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna.
• skapar ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom

Question 11

Vad gör SDS, IEF, 2-D och western blot?

Answer 11

SDS= separerar proteiner efter storlek
IEF= separerar proteiner efter skillnad i isoeletrisk punkt
2-D= separerar proteiner först efter isoelektrisk punkt sedan storlek.
Western blot= separerar proteiner och detekterar med antikroppar.

Question 12

Vad är den isoelektriska punkten “IP” ?

Answer 12

Isoelektrisk punkt är det pH där nettoladdningen hos ett protein är noll.

• Proteiner kan inte röra sig i ett elektriska fält när de nått sin isoelektriska punkt pga att de är oladdade.
• Det utnyttjas vid isoelektrisk fokusering.

Question 13

Hur ändrar proteiner laddning ?

Answer 13

Dem ändrar laddning beroende på pH i omgivningen.

Question 14

Hur vandrar proteiner i gelen och stannar dem ut?

Answer 14

• > Provet med proteinerna laddas på pH-gradienten och de vandrar pga sin laddning till IP dvs när nettoladdningen är noll.
• > Olika proteiner har olika IP och blir elektriskt neutrala vid olika pH:n dvs stannar på olika ställen i gelen.

Question 15

Hur bildar man pH gradienten i en buffert?

Answer 15

• Använda sig av buffrande grupper som binds kovalent till gel massan. Sura och basiska buffrande grupper blandas

Question 16

Hur kan vi få proteiner att separeras bara med avseende på storlek?

Answer 16

Först värmebehandlar man provet i närvaro av DTT för att proteinet skall återfå primär struktur.

• DTT bryter disulfidbryggorna i proteinet
• Värme denatuerar proteinet
• SDS adderar negativ laddning

Question 17

vad gör SDS med proteiner?

Answer 17

• > SDS binder in till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra. Effekten blir att laddning/massa blir på konstant på proteinet
• > Denaturera proteiner till enskilda polypeptider genom att SDS förhindrar nästan alla icke-kovalenta interaktioner i proteinerna-
• > SDS tillsätts och gör att proteinet blir - laddat.
• > SDS lägger sig runt proteinet och maskerar då proteinets egna nettoladdningen. Alla proteiner får samma negativa laddning relativt till sin storlek och då spelar inte aminosyrasammansättningen någon roll. Proteiner separeras endast beroende på storlek

Question 18

Hur fungerar SDS-PAGE?

Answer 18

• Orsakas storleks separationen av hur tätt nätverket av akrylamid är.
• Stora proteiner bromsas upp mer än små, och vandrar därför långsammare.

Question 19

Hur kan man sammanfatta hur proteiner vandrar?

Answer 19

• När proteinerna har sin primärstruktur och är negativt laddade förflyttar de sig mot den positiva elektroden.
• Proteinerna separeras efter storlek
• Proteiner med lägre molekylvikt rörsig snabbare i gelen.
• För att visualisera proteinerna färgas gelen efter separationen.

Question 20

Vad får vi ut av SDS-PAGE?

Answer 20

Bestämmer proteinet renhet, storlek och koncentration samt identifierar proteiner.

Question 21

Vad använder man 2-D-elektrofores till?

Answer 21

• > Separera tusentals proteiner på samma gång
• > Bestämma proteinernas isoelektriska punkt
• > Bestämma proteinernas molekylvikt
• > Bestäm relativ mängd av varje protein.
• > identifiera proteiner med masspektrometeri

Question 22

Hur fungerar western blot metoden?

Answer 22

En metod för att detektera specifika proteiner i en proteinblandning.
- En kombination av
SDS-PAGE och detektion med specifika antikroppar
- Vanligt inom cell- och molekylärbiologisk forskning.

Question 23

Vad finns det för detektionssystem för WB?

Answer 23

• Finns olika detektionssystem, fluorescens, kolorimetrisk
• Vanliga substrat är HRP och AP
• Primär och sekundär antikropp använd.

Question 24

Vart kommer agaros gelen ifrån?

Answer 24

Den kommer från rödalger och är gjord av långa kedjor av länkade polysackarider som skapar ett nät.