Semaine 7.1 Flashcards
Expliquez la statégie historique pour isoler un gène d’un organisme eucaryote quand la protéine codée par le gène est connue.
- Cloner chez un plasmide ou (plutôt) chez λ l’ADN complémentaire à l’ARNm du gène
d’intérêt. On identifiait les clones voulus soit par hybridation de colonies ou de plages en se servant
d’une sonde marquée au 32P soit par une méthode immunologique. - Cloner l’ADN génomique, contenant le gène d’intérêt, chez λ. On se servait de l’ADNc cloné
comme sonde pour identifier les clones voulus. - Sous-cloner chez un plasmide l’ADN contenant le gène ou une partie de ce dernier.
- Se servir des séquences clonées pour fins d’analyse (de séquence, par exemple) ou de synthèse
(production de la protéine, par exemple).
Comment faisait on dans la méthode historique pour identifier les clones d’ADNc recherchés ?
on partait souvent de la protéine codée par le
gène d’intérêt.
On part de la protéine codée par le gène d’intéret
Soit on connait seq en a.a soit un possédait un anticorps capable de reconnaitre la protéine
A partir d’un petit bout de séquence peptidique on pouvait prévoir les séquences codantes correspondantes (dégénérées, bien sûr!) et faire synthétiser un
mélange d’oligonucléotides approprié.
a.a : On marquait les oligos en 5 avec du 32P et on s’en servait comme sonde pour cribler une banque d’ADNc.
Anticorps: Si l’on posédait un anticorps, on pouvait préparer une banque d’ADNc à l’aide d’un vecteur d’expression et identifier les clones recherchés en criblant avec l’anticorps.
Comment faisait on dans la méthode historique pour identifier les clones d’ADN génomique recherchés ?
il fallait également obtenir l’ADNc (en se servant cette fois-ci de séquences exoniques du gène comme sondes) et ceci parce qu’il fallait posséder l’ADNc pour déterminer les endroits où se situent les introns dans l’ADN génomique
Quelle est la différence entre la méthode sanger automatique et manuel
Dans la méthode manuel on analyse les gels qui ont séparés les fragments par taille.
Expliquez le clonage
Dans une bactérie, on sélectionne le plasmide Pour cela on casse la cellule et part la suite on purifie les vecteurs. Une fois cela fait, on insère notre ADN dans le plasmide qui a été purifié. Nous avons alors un plasmide recombinant, constitué de plasmide et de l’ADN. Ensuite, on intègre le plasmide recombiné dans une bactérie, qui deviendra alors la bactérie hôte. On procède pour cela à un choque thermique afin de rendre les cellules compétentes et qu’elles puissent intégrer le plasmide recombinant. Par la suite, on procède au repérage. Pour cela, on étale les bactérie transformées sur un milieu sélectif. Alors, les bactéries possédant le recombinant pousseront. On sélectionne alors ces bactéries capables de pousser en milieu sélectif et on les casse les cellules d’un seul clone. On purifie par la suite le plasmide recombinant
Avec quoi on identifie les clones les mutations ?
On les vérifie ?
Deuxieme génération
Sanger, plus précis
Vrai ou faux : Les action exonucléasiques et polymérasique de l’ADN polymerase i se fait en même temps
vrai
Comme fonctionne le criblage d’une banque avec une sonde
Avant le criblage ont étale les centaines de millier de phage sur de grande boites d’agar sur lesquelles on fait pousser un tapis bactérien.
Quand les phages sont visibles, on place un filtre de nylon ou de nitrocellulose sur la boite.
Alors le filtre va absorber le fitlre. Grâce à ça, on sait exactement comment sont disposés les phages
Ces filtres sont traités pour éliminer les protéines du phage et pour fixer l’ADN sous forme monocaténaire à la membrane
Le filtre est ensuite incubé dans une solution contenant la sonde d’ADN ou d’ARN marqué avec du 32 p dont la séquence est complémentaire à un fragment du clone que l’on recherche.
Puis, les filtres sont lavés pour éliminer la sonde qui ne s’est pas fixée et il ne reste plus que les molécules associées de façon stable aux séquences complémentaires de l’insertion clonée du phage.
Pour déterminer où s’est fixée la sonde, on expose le filtre à un film sensible (autoradiographie).
La position de la sonde est repérée par un point noir et en orientant le film par rapport à la boîte d’origine, on peut déterminer quelle est la plage à laquelle la
sonde s’est hybridée et l’isoler.
Comment faire si on ne dispose pas d’une sonde d’acide nucléique pour cribler une banque
Quelle est la difficulté?
Comment la régler ?
on peut concevoir sa séquence et la faire synthétiser à partir de la séquence de la protéine.
On fabrique alors un oligonucléotide
composé des codons dont on sait qu’ils correspondent aux acides aminés de la protéine.
On cherche à trouvés quelle séquence correspondent aux a.a, mais plusieurs codons peuvent coder pour un a.a
Alors l faut fabriquer un mélange d’oligonucléotides dans lequel tous les nucléotides correspondant aux positions ambiguës sont représentés.
On fait un mélange d’oligonucléotides différents qui reflètent toutes les séquences pouvant
correspondre aux acides aminés en question.
La complexité de ce mélange de séquences peut être réduite en utilisant une séquence de 17 nucléotides de long plutôt que de 18 puisque ainsi la troisième position dégénérée du dernier codon est éliminée.
Quand on fabrique des oligonucléotides, que sont les stratégies possibles
Sond dégérée; n mélange d’oligonucléotides dans lequel tous les nucléotides correspondant aux positions ambiguës sont représentés.
On fait un mélange d’oligonucléotides différents qui reflètent toutes les séquences pouvant
correspondre aux acides aminés en question
On alors plusieurs séquence
l’une d’elle s’hybridera à l,ADNc du gène d’intérêt.
Ou alors on fait un Guessmer unique . 1 séquence nucléotidique mais bcp plus longue .
Le guessmer s’hybride alors de façon imparfaite avec le gène cloné. Si
les régions complémentaires sont importantes, de l’ordre de 10 à 12 paires de bases, l’hybridation de ce guessmer sera suffisamment spécifique pour que l’on obtienne un signal
Comment on procède à un criblage avec des anticorps:
On utilise un anticorps dirigé contre une protéine pour cribler une banque d’ADNc.
Dans le vecteur phagique λgt11, le site de clonage EcoRI est situé dans la région codante du gène lacZ d’E. coli.
Les ADNc qui y sont intégrés, s’ils se trouvent dans l’orientation et cadre de lecture corrects, sont traduits en une protéine de fusion constituée d’un fragment de la β-galactosidase et de la protéine codée par l’ADNc.
Lorsque les phages sont étalés, les plages de lyse contiennent cette protéine de
fusion produite par les phages.
Ces protéines sont ensuite transférées sur des filtres de
nitrocellulose .
la position des plages dans lesquelles une protéine correcte est produite peut être mise en évidence par des anticorps.
Normalement, on incube le filtre dans une solution contenant l’anticorps qui se fixe alors à la protéine présente sur le filtre.
Cet anticorps est en général révélé en incubant le filtre dans une solution contenant un second anticorps marqué dirigé contre le premier.
A quoi ça consiste de fabriquer une banque génomique dans un vecteur du phage lambda.
Quelle est la restriction
On insère un fragment d’ADN de la souris
Il est mis dans l’ADN lambda.
Ensuite encapsidation in vitro
on a un phage lambda qui porte l,ADN de la souris
La taille l’encapsidation est limitée
Quelle st la taille optimale pour l’encapsidation dans un phage
15 kb, la
taille optimale pour l’encapsidation du phage, s
Quel est l’intéret des ESt?
Expressed sequence tags
fournissent entre autre un passage facile de la séquenc epeptidique partielle à l’ADNc cloné
Chaque EST correspond à un ou des
exons d’un gène exprimé
outil numéro un pour l’annotation des génomes séquencés. En effet on peut s’en servir pour identifier les exons des gènes. Dans le dessin à gauche, le gène aurait quatre exons et trois introns. Les EST sont représentés par les lignes courtes
Peuvent êtres utilisés pour : Obtenir une longueur d’ADNc de pleine longueur
- Analyse du génome et mapage
- Expression du gène
- Gène spécifique de clones
D’où viennent les EST ? S
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