semaine 10 Flashcards
que sont les études d’association avec un marqueur polymomorphe ?
Les pangénomique ?
= association d’une maladie polymorphe avec maladie
ou condition
=Étude d’association pour un seul SNP
On constate maladie polymorphe sera en plus grande quantité chez des patents atteints d’une maladie
que sont les études d’association pangénomique
Comment on l’étudie
Eude d’association pour plusieurs SNP
On faits graphique de manathan qui rpz les dif chromosomes. Ceux qui se distinguent sont des SNP qui montre une
association avec la maladie
quelle est la “fail” des études pangénomiques
pourquoi
On connait très mal les rôles et les fonctions
car l’augmentation de risque pour le SNP
est de 1,05
environ
Ce n’est pas surprenant : c’est difficile d’étudier
comment un facteur (SNP) agit pour augmenter le
risque d’attraper une maladie de 5 % seulement…
Quelle est la grosse différence entre
mutations mendéliennes sont rares à pénétrance
élevée
SNP fréquents à pénétrance très faible identifiés
par GWAS
comment appelle-ton culture les cellules de
mammifères isolées directement d’un animal
on parle de cellules en culture primaire
ou de cellules primaires
Est ce que les cellules humaines sont immortelles ? que cela signifie si elles le sont ?
Non
qu’une lignée cellulaire humaine est devenue immortelle en culture de façon spontanée il faudra plutôt penser qu’elle est un contaminant …comme le cellules HeLa par exemple !
Comment rendre une cellules humaine immortelle
Virus
adenovirus, SV40
Par exemple le virus d’Epstein-Barr peut
immortaliser les lymphocytes B en culture
Qu’est ce que la fusion cellulaire ?
On peut considérer la fusion cellulaire
comme le transfert du génome entier
d’une cellule à une autre
qu,est ce qui peut provoquer une fusion de noyau ?
La fusion peut être provoquée
soit par le virus de Sendai
soit par le polyéthylène glycol
(PEG)
À quoi ça sert d’obtenir des
cellules hybrides ?
À l’époque cela a permis de placer les gènes humains sur leurs chromosomes (nous n’en parlerons pas) La fusion cellulaire permet aussi d’effectuer des tests de complémentation avec cellules de mammifères
Comment obtenir des anticorps monoclonaux ? que sont ils ?
L’obtention des anticorps monoclonaux passe par la fusion de cellules de myélome de souris (immortelles) et cellules de la rate (productrices d’anticorps) → hybridomes
disons seulement que ce sont des anticorps qui sont beaucoup utilisés comme outils en recherche et en clinique
Que signifie transfection
Le terme transfection est utilisé chez les cellules eucaryotes pour décrire le processus appelé transformation chez les bactéries C’est-à-dire que l’ADN nu pénètre dans la cellule cible
Que sont les différentes méthodes pour pour faire pénétrer l’ADN nu à l’intérieur des
cellules de mammifères
coprécipitation au phosphate de calcium
• électroporation
• lipofection
A quoi servent les vecteurs d’expression
Les vecteurs d’expression servent à assurer la transcription et la traduction des séquences codantes dans les cellules de mammifères
quel est le rôle de Ori dans le plasmide
A quoi sert les gènes de résistance
Ori ColE1 sert comme origine de replication
du plasmide chez E. coli
permet la sélection du plasmide chez E. coli
C’est dans E. coli qu’on fait répliquer le
plasmide
pour en avoir en grande quantité
comment avoir une expression stable d’un ADNc? pourquoi est elle défini de stable
Afin d’obtenir l’expression stable d’un ADNc
on peut cloner l’ADNc et le gène neo
dans un même plasmide
et sélectionner des transfectants stables en
présence de G418
Ces cellules vont synthétiser la protéine codée
par le gène ou ADNc d’intérêt dans le vecteur
d’expression
Et dans ce cas l’expression sera maintenue
dans le temps
Pour cette raison elle est dite stable
Quelles sont les différence entre l’expression stable et transtitoire
Expression stable
sélection obligatoire
- délai de 2 à 3 semaines
- l’ADN s’intègre
Expression transitoire
-aucune sélection nécessaire
délai de 24 ou 48 heures
- l’ADN demeure extrachromosomique
Quand l’ADN s’intège, le fait il de manière aléatoire ou précise
L’intégration de l’ADN étranger au
génome de la cellule transfectée se
fait de façon aléatoire
n’importe quel séquence d’ADN qui se
trouve à l’intérieur du noyau
va s’intégrer au génome de façon aléatoire
(message à retenir !!)
Que sont les raison de fairre des transfections
régulatrices de la transcription
• pour vérifier l’activité biologique de la protéine
codée par un ADNc cloné
• pour étudier à l’intérieur de cellules le
mécanisme d’action d’une protéine quelconque
donnez un exemple de transfection pour • pour vérifier l’activité biologique de la protéine
codée par un ADNc cloné
LDL
Des clones positifs avec les deux sondes
ont été retenus
obtenir l’ADNc humain
Comment peut-on confirmer que
l’ADNc cloné code vraiment pour le
récepteur des LDL ?
Transfection pour vérifier l’activité
biologique de la protéine codée par
un ADNc cloné
cellules sans LDL dans lesquelles il ya eu transfection de vecteurs
recepteurs sont survenues
Cette expérience confirme que l’ADNc cloné
confère
lorsque exprimé
l’activité biologique des récepteurs des LDL
C’est-à-dire :
il code pour le récepteur des LDL
Pourquoi on pense que que le mécanisme de la
régulation du cycle cellulaire est conservé entre
S. pombe et l’humain
Un homologue humain du gène cdc2 de a été cloné
par l’expression d’une banque d’ADNc humain chez
S. pombe en sélectionnant pour des clones pouvant
restaurer le phénotype sauvage à un mutant cdc2
La séquence peptidique de la protéine humaine est
très similaire à celle de S. pombe
Quelle est l’autre méthod epour arriver à
incorporer l’ADN dans le génome de
cellules cibles
On se sert de lentivirus transducteurs
dérivés du rétrovirus HIV
Pourquoi les lentivirus
transducteurs infectent toutes sortes de cellules
La glycoprotéine de surface des lentivirus
transducteurs est remplacé par celle du
virus de la stomatite vésiculaire (VSV)
ce qui confère sur les lentivirus transducteurs la
spécificité d’infection de VSV
Or, VSV se fixe sur le bien connu (de vous !!)
récepteur des LDL – un récepteur ubiquitaire –
Quelle est la fonction des lentivirus ? comment ça fonctionne ?
les lentivirus transducteurs fournissent une autre méthode (que la transformation) pour faire pénétrer l’ADN étranger dans des cellules en culture Cette pénétration se fait par endocytose par l’intermédiaire récepteur des LDL (« receptor-mediated endocytosis »)
qu’est ce qu’un transgène ?
un animal transgénique ?
Quand on AJOUTE un gène (ou un ADNc) au bagage génétique d’un animal ou d’une plante on appelle le gène un transgène et l’animal ou la plante transgénique
comment on appel le fait qu’on inactive un gène dans le génome d’un animal
quand on inactive spécifiquement un gène
dans le génome de la souris (ou autre espèce)
on parle d’inactivation ciblée
(barbarisme à bannir : « knock out »)
comment coté t’on la présence de transgène dans unanimal
La présence du transgène dans la descendance est révélée par PCR à l’aide d’oligos spécifiques au transgène On obtient du sang en coupant la queue
Comment on obtient des C.elegans trasngeniques
Microinjection d’ADN dans le gonade d’un
hermaphrodite
Cela mène à la transformation des cellules
germinales
Comment on obtient des souris trasngeniques
La microinjection de l’ADN d’intérêt se fait dans le pronucléus mâle d’un oeuf fécondé
On féconde les gamètes mâles et femelles
on y insère le gène d’intéret
on l’injècte dans le pronucleus
On implante les oeufs dans une femelle pseudogestante
La présence du transgène dans la descendance est révélée par PCR à l’aide d’oligos spécifiques au transgène On obtient du sang en coupant la queue
Pour les droso et plante, en GROS commen tse passe la transgeni?
qu’il s’agit toujours de l’ajout d’un
(trans)gène au bagage génétique de l’espèce
Quel est le but d’inactiver un gène
afin de vérifier les effets phénotypiques
dus à l’absence de sa protéine
Donc le but de l’inactivation ciblée est d’obtenir des homozygotes récessifs pour un gène X c’est-à-dire du génotype xx Il s’agit de mutations de perte de fonction créées à volonté
citez un exemple de mutation de perte de fonction dominante
Mutant Notch.
Maladie de darier
Neurofibromatose
Comment expliquer qu’un mutant soit une perte de fonction ET dominant
les homozygotes n’existent pas à cause de
l’effet récessif létal
Si les homozygotes existaient
on aurait dit qu’il y a absence de dominance
quelle est la conclusion que nous a procuré dollY?
il faut conclure qu’il n’y a pas de changements de séquence d’ADN au cours du développement au moins pour les cellules dont les noyaux ont servi pour le clonage !!
citez deux maladie à expansion de triplets
Le syndrome de l’X fragile et la maladie de Huntington représentent deux grandes catégories de maladies à expansion de triplets et les principes qui s’appliquent à elles s’appliquent à la plupart des autres maladies du même genre
Qu’est ce qu’une maladieà expension de triplet
Est elle un gain ou perte de fonction
Un type de mutation souvent rencontrée est
l’expansion de trinucléotides répétés.Le nombre de répétitions des triplets de départ
est donc variable dans la population normale
Ils sont polymporphes dans la population
normale
Elle est perte de fonction
ou de gain de fonction toxique
Quel est le but de l’inactivation ciblée de gènes chez la souris
est d’obtenir des homozygotes récessifs pour un gène X c’est-à-dire du génotype xx Il s’agit de mutations de perte de fonction créées à volonté
Dans les expansion de triplets, est ce que dans les population normales elles sont polymorphes ?
Oui et cela n’a pas de conséquences phénotypiques
Citez deux maladies due à des expansions de triplets ?
où sont ils
Syndrome de l’X fragile et maladie de Huntigton
X fragile :
5”UTR
Gène maladie de Huntington: codante
A quoi sont dues les maladies à expansion de triplets
Les maladies sont dues à une expansion du
nombre de triplets au delà d’un seuil
Le seuil est différent pour chaques maladie
Quel est le gène pour la maladie de l’X sauvage ?
protéine ?
Dans quel cas le phénotype est normal ?
anormal ?
FMR1
FMRP
Normal : expansion de 5 à 55.
Prémutation : 55 à 200
Mutation ful : Plus de 200
Dans le gène FRM1, en quoi est il polymoprhe
Pour un phénotype normal il y a une suite de 5 à 55 triplets de CGG.
Le nombre de répétitions des triplets de
départ est donc variable dans la population
normale
Il y a un polymorphisme concernant le nombre de triplet de la population
Dans la plupart des cas où le triplet de
départ est dans une région codante, quel est le codon répété?
Dans quelle maladie ça s’applioque
il est un codon de la glutamine
CAG
Donc cela correspond à une suite de
résidus de la glutamine dans la protéine
Dans la région codante de l’ARNm du gène de la maladie de Huntington de personnes normales le gène HD il y a une suite de 11 à 34 triplets CAG Ceci signifie que dans la protéine correspondante il y a une suite de 11 à 34 résidus de la glutamine
A quoi sont dues le syndrome de l’X fragile et d’Huntington
Les maladies sont dues à une expansion du
nombre de triplets au delà d’un seuil
Que sont les types de répétitions dnas un région codante
Non codante ?
CAG dans une région codante
CGG dans une région non codante (5’ UTR)
• GAA dans une région non codante (intron)
• CTG dans un région non codante (3’ UTR)
Pourquoi le nom X fragile
Comment le mettre en évidence
Il s’avère que le site sur le chromosome X où
se trouve l’expansion est « fragile »
C’est-à-dire que le chromosome a tendance à
« casser »
Par coloration
Quelle est la maladie la plus férquente de retard mental
Le syndrome de l’X fragil
Quel est la conséquence pour une femme d’avoir une prémutationdu gène FRM1
homme ?
Augmente le risque d’avoir un enfant avec le syndrome de l’X fragile
Les hommes ne passent la prémutations qu’à leurs filles, par à leur fils car donne un Y. Donc moins de risque
Que sont les caractéristiques de maladies à
expansion de triplets où le triplet de départ
se trouve dans une séquence non codante
qu’il y a des symptômes physiques ainsi que
mentaux
visage caractéristique, macroorchidisme
(grandes testicules)
Pour une femelles hétérozygore, si dans une
cellule femelle donnée le chromosome X ayant
l’allèle sauvage de FRAXA est inactivé quel est l’impact
Pourquoi
ça va aller mal pour la cellule !
La protéine FRAXA (FMRP) fait son travail à
l’intérieur de la cellule
Elle n’est pas sécrétée comme les facteurs de
coagulation sanguine VIII et IX par exemple
Pourquoi les femmes Hétéroxygotes avec le syndrome de X sont particulierement affectées
La protéine FRAXA (FMRP) fait son travail à
l’intérieur de la cellule
La mutation du syndrome de l’X fragile est elle dominante ou recessive
les termes « dominant » et
« récessif » ne s’appliquent pas dans ce cas
La protéine FRAXA (FMRP) fait son travail à
l’intérieur de la cellule
C’est sans doute pour cela que les femmes
hétérozygotes sont affectées
mais moins que les garçons (et les hommes)
d’où la difficulté à décider si la mutation est
dominante ou récessive
expliquez un cas où le mécanisme de
compensation de dose des mammifères
fait que les femmes hétérozygotes pour
une mutation de perte de fonction
Le syndrome de l’X fragile
Que sont les caractéristiques de des maladies à expasnion de triplets où le triplet de départ se trouve dans la séquence codante
les
effets sont restreints au cerveau
Les symptômes qui sont uniquement mentales ou « neuronales » sont dus à la dégénérescence de cellules neuronales particulières
La maladie de Huntington est elle dominante ou recessive
mutation autosomale dominante • c’est un cas de dominance « pure » – c’est-à-dire l’hétérozygote et l’homozygote muté semblent avoir le même phénotype • il s’agit d’une mutation de « gain de fonction »
Présentez un cas de mutation de gain de fonction
Maladie de Huntington
Quel est le nombre de triplet pour un phenotype normal dans la maladie de Huntington ?
Si c’est au délà
8 à 35
Celles avec 36 à 39 triplets CAG peuvent en
être atteintes (→ pénétrance partielle donc)
Celles avec ≥ 40 triplets CAG seront
atteintes
les prémutations existent elles dans la maladie de Huntington?
que peuvent elles crééer
les prémutations (27 à 35 triplets)
Les pré-mutations sont sujets à l’expansion
pour créer des mutations (>40 triplets) chez
l’homme
vrai ou faux:
Les pré-mutations sont sujets à l’expansion
pour créer des mutations
vrai pour les hommes pour la maladie de Huntington
Faux pour l’X fragile
quel est la gène de la maladie de Huntignton .
Comment voir si sa perte serait létale
Hdh
On inactive le gene Hdh Chez une souris
Pourquoi chez l’humain les homozygotes HDm/HDm vivent jusqu’à 40 ans et chez les souris les homozygotes Hdh− /Hdh−
meurent au jour embryonnaire 7,5
L’expansion du triplet CAG qui provoque la
maladie de Huntington serait une mutation de
« gain de fonction »
La huntingtine ayant une suite de ≥ 40 résidus
de Gln conserverait son activité biologique
normale
Mais elle acquerrait une nouvelle « fonction »
toxique pour certaines cellules neuronales
Citez une maladie qui illustre l’utilité de pouvoir identifier des individus
portant une mutation dominante
responsable d’une maladie génétique
maladie de Huntington
LEs triplet d’alanine sont ils une perte ou un gaind e fon ction
les deux
